內質網應激與肝纖維化關系研究進展*

潘高峰 綜述，傅茂英，郜玉峰 審校

內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是生物細胞為了抵御外界各種病理刺激所產生的一系列維持自我穩態的病理過程。肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是各種慢性肝病的共同病理過程，持續HF可進展至肝硬化，甚至肝惡性腫瘤，是慢性肝病防治的棘手問題。ERS與多種器官纖維化相關[1]。目前研究認為，ERS可通過介導細胞凋亡、調節HF相關因子的表達等途徑參與HF的發生發展及逆轉。

1 ERS與未折疊蛋白反應

內質網作為生物細胞的重要細胞器，廣泛參與蛋白質及脂酯的轉運及處理。多種病理刺激可使內質網處理細胞內蛋白的能力下降，導致內質網腔中蛋白質大量聚集及錯誤折疊，破壞細胞原有穩態。ERS是細胞自我保護反應，為了使細胞適應外界環境改變，內質網會啟動、活化一系列信號傳導通路，以處理這些未折疊及錯誤折疊蛋白，該過程被稱為未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）[2]。未折疊蛋白分子與糖調節蛋白 78（glucose regulated protein 78，GRP78/Bip）結合，使得Bip與內質網膜上的三種感受蛋白：RNA依賴的蛋白激酶樣激酶-真核翻譯始動因子2-α（protein kinase RNA-like ER kinase-eukaryotic initiation factor2α，PERK-Eif2α）、激活肌醇酶（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）及活化轉錄因子 6（activating transcription factor 6，ATF6）解離出來，分別激活三條信號通路：（1）PERK-eIF2α 通路：激活的PERK使真核翻譯調節因子eIF2α磷酸化，在翻譯水平抑制蛋白質合成；（2）IREl-XBPls通路：激活的IREl剪接轉錄因子XBPl mRNA，產生活化的XBPls蛋白質，后者在轉錄水平上調控ERS相關基因的表達；（3）ATF6通路：激活的 ATF6進人細胞核，可調節 XBPl、分子伴侶等其他ERS相關基因的轉錄和表達。若UPR過強或持續時間過長則會上調CCAAT增強子結合蛋白同源蛋白 （CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）的表達，引起細胞凋亡蛋白天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶 12（cysteinyl aspartate specific proteinase-12，caspase-12）的剪切活化，從而促進細胞凋亡。

2 HF的主要機制

HF主要由于肝內細胞外基質（extracellular matrix,ECM）特別是間質膠原過度沉積所致[3]，其形成過程十分復雜。目前認為肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）是各種促HF因素作用的最終靶點。此外，細胞因子的參與、微小RNA異常表達、遺傳因素、腸道菌群紊亂以及免疫細胞等也與HF相關。

2.1 HSC與HF 正常靜息狀態下，HSC很少產生ECM。炎癥、損傷等刺激可使HSC活化。活化的HSC除了可以合成并分泌α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和I型、III型膠原蛋白外，還可直接分化為肌成纖維細胞（myofiborblast，MFB），最終促進 HF 的形成。目前認為[4～9]，轉化生長因子β1/smad（TGFβ1/smad）通路、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）通路、瘦素（leptin）通路、ROS-mediated ERK/JNK s通路、整合素（integrin）通路及Wnt信號轉導通路等參與了HSC的活化。另外，當HSC凋亡相對不足時，也可促進HF的形成。

2.2 細胞因子與HF報道認為：血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）可通過激活 HSC 參與HF的形成及發展[10]。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）一直被認為是一個重要的促HF因子。結締組織生長因子（connective tissue growing factor，CTGF）是一個重要的促HF因素，可通過抑制其來抑制HSC的激活來預防 HF 的發生[11]。此外[12]，IL-10、IL-15、IL-17、IL-20、IL-22與HF的發生發展也密切相關。

2.3 微小RNA與HF 微小RNA是近些年研究熱點。它是一個內源性非編碼單鏈RNA，其可在轉錄后水平對靶基因進行調控[13]。在HF病程中，多種微小RNA與HSC的激活相關。微小RNA既可促進HF的發生發展，也可抑制HF的發生發展。例如，micro-21可通過多種途徑促進HF發生發展[14]，而micro-15b、micro-16及micro-29可抑制HF的發生發展[15，16]。

2.4 遺傳與HF遺傳因素也參與了慢性肝病的發生發展。目前認為基因的多態性可以從多個方面影響HF的發生發展[17]。基因的多態性可從疾病易感性，免疫及炎癥反應，損傷及修復機制以及損傷后基質重建等方面對HF的發生發展產生影響[18]。有研究發現[19]，慢性乙型肝炎患者血清中IL-10水平有差異，那些基因多態性592號堿基缺失的患者更易被HBV感染，并產生包括HF在內的疾病進展。此外，CXXL10、CD24/CollA1以及血管緊張素原等基因的多態性也影響著慢性乙型肝炎的預后。鑒于種族差異，這種等位基因的多態性分布及頻率也會不同，故我國HF與基因多態性的關系不能照搬國外，仍需大規模臨床試驗及基因組研究來探索。

2.5 腸道菌群紊亂與HF 目前研究認為，腸道菌群與人體的多種病理生理過程相關。正常的腸道菌群有益于機體的健康，但紊亂的腸道菌群可導致及加重一些疾病[20]。腸道菌群紊亂與HF發生發展密切相關[21]，前者可促進后者的發生發展，后者亦可使前者加重。機體一旦發生腸道菌群紊亂，藥物的代謝、維生素的合成等功能會減退，可加重肝細胞損害，同時腸道粘膜屏障的破壞可致肝細胞凋亡壞死，最終促進HF的發生發展[22，23]。另外，腸道菌群紊亂可促進一些炎癥因子的釋放，而炎癥因子又可導致HSC的活化及增值。故腸道菌群紊亂間接參與了HF的形成。

3 ERS與HF

3.1 ERS介導的細胞凋亡參與HF目前認為，ERS與病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝、中毒性肝損傷、肝衰竭等多種肝臟疾病密切相關[24]。a1抗胰蛋白酶缺乏者因大量突變的a1抗胰蛋白酶在肝細胞內聚集而誘發ERS，最終引起肝臟疾病。研究表明[25]：在a1抗胰蛋白酶突變的轉基因小鼠HF模型中，ERS相關蛋白BIP、CHOP的表達與HF密切相關。CHOP蛋白可能通過上調促纖維化因子aSMA、TGF及膠原蛋白的表達導致HF[25，26]。也有報道認為[1]，ERS促進了基因突變及損傷模型中HF進展，其中CHOP蛋白可能通過調節肝細胞的存活發揮重要作用。藥物誘導的ERS在體內及體外均可促進HSC的凋亡，從而抑制HF的形成[27]。CCl4誘導大鼠HF模型中，ERS相關分子Tribbles同源蛋白3（tribbles homolog 3，TRB3）和CHOP在蛋白及mRNA表達水平均增加，其變化趨勢與大鼠肝細胞凋亡率一致，提示ERS可能通過TRB3和CHOP促進肝細胞凋亡，參與HF發生發展。作為C/EBP轉錄因子家族的一員，CHOP可通過下調抗凋亡基因B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）的表達來促進細胞凋亡。推測CHOP蛋白可通過促進HSC的凋亡來抑制HF的發生發展。

Caspase-12是ERS介導細胞凋亡的一個主要調節因子。研究表明，caspase-12通路與膽汁淤積性HF發展密切相關。在非酒精性脂肪肝模型中，阻斷ERS的caspase-12通路有助于非酒精性HF的恢復[28]。CCL4誘導大鼠HF模型中，ERS標志性蛋白Caspase-12可能與HF的發生、發展和恢復逆轉密切相關[29]。有報道指出[30]，ERS在HF的進展期抑制HSC活化，在HF逆轉恢復期促進活化的HSC凋亡。因此，caspase-12可通過調節HSC凋亡來參與HF的發生發展及逆轉。

目前認為[31]，咖啡因具有抗HF作用，而咖啡因可能通過調節HSC的凋亡來發揮抗HF作用[32]。進一步研究發現[33]，咖啡因可通過ERS的IREl通路來促進HSC的凋亡從而發揮抗HF作用。

3.2 ERS通過細胞因子及活性氧簇參與HFERS與諸多細胞因子存在密切聯系，HF的發生發展與 TGFβ、PDGF、TNF-α、CTGF、IL-10、IL-15、IL-20、NF-κB 等多種細胞因子相關。UPR誘導的凋亡可以導致TGF-β的釋放，進而刺激HF的發生發展。故ERS可通過調節相關細胞因子的表達來參與HF的病程。ERS與活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）密切相關，二者可互相促進，而ROS在誘導肝損傷及HF中發揮著重要的作用[34]，因而ERS可通過ROS介導HF的發生發展。

3.3 MANF與HF中腦星形膠質細胞源性神經營養因子（mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF）基因是有從數千個基因中篩選出來的并對ERS最敏感的基因，其編碼的MANF蛋白為分泌性蛋白。MANF在慢性乙型病毒性肝炎、腦缺血、心肌缺血再灌注等疾病中具有細胞保護作用。前期研究發現[35]，慢性HBV感染者HF的進展與其外周血中MANF m RNA水平正相關。針對慢性HBV感染者外周血MANF蛋白研究發現[36]，乙型肝炎肝硬化組MANF蛋白表達水平較正常對照組及慢性HBV攜帶組低，推測MANF蛋白下降可能通過某種機制參與了乙型肝炎肝硬化的病程；乙型肝炎表面抗原＞20000IU/ml組MANF蛋白表達水平低于乙型肝炎表面抗原＜15000IU/m l組。目前普遍認為，乙型肝炎表面抗原水平越低的患者肝硬化程度越重，這與上述外周血MANF m RNA水平研究結果一致。因此推測，MANF蛋白在HF早期適度的ERS中起著肝臟保護作用。然而，ERS相關蛋白MANF與HF的關系有待進一步深入研究。

3.4 ERS信號通路相關因子與HF 前期研究發現[37]，與正常健康對照組相比，慢性無癥狀HBV攜帶組、慢性乙型肝炎組及乙型肝炎肝硬化組外周血中GRP78 mRNA及 XBP1 mRNA水平均升高。其中，乙型肝炎肝硬化組上述兩個ERS相關指標mRNA水平與慢性無癥狀HBV攜帶組及慢性乙型肝炎組比較均有下降趨勢，推測ERS參與了乙型肝炎肝硬化病程。經奧曲肽皮下注射處理后的大鼠HF程度低,同時該組大鼠血清中的GRP78及XBP1蛋白水平亦低，而GRP78與XBP1又是ERS相關蛋白，故奧曲肽可能通過減輕肝臟的ERS反應來緩解HF[38]。肝臟組織勻漿中丙二醛高水平表達提示存在氧化應激。在小鼠肝硬化形成過程中，GRP78表達水平與丙二醛表達水平正相關[39]。前者為ERS相關蛋白，后者代表著氧化應激，提示ERS可能通過氧化應激參與HF病程。研究認為[40]，血清鐵可通過激活HSC促進HF發生發展，而瞬時敲出GRP78基因后血清鐵促HF作用減弱。推測，血清鐵可能通過ERS相關蛋白GRP78來發揮促HF作用。研究認為[41]，抑制IRE1α-XBP1信號通路可降低HSC活化及自噬來抑制HF。Piskounova[42]et al研究提示，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinam-ide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOXs）參與了 HF 的發生及發展。進一步研究發現[43]，NOXs在HF中促進ROS的產生，進而介導UPR中IRE1α-XBP1信號通路的激活及ERS的發生。因而，IRE1α-XBP1信號通路參與了HF的病理生理過程。也有研究指出[44]，發生在HSC中的ERS可通過PERK介導的核內不均一性核糖核蛋白A1（heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A1，hnRNP A1）下調及 SMAD2 上調來促進HF的發生發展。綜上所訴，ERS信號通路中相關因子 GRP78、XBP1、IRE1α 及 PERK參與了 HF的病理過程，但他們參與HF的具體機制尚有待深入研究。

3.5 ERS通過微小RNA參與HF目前研究認為[45，46]，ERS可通過與微小RNA之間的相互作用參與一些病理生理過程。Upton[47]et al提出XBP1是激活微小RNA-346表達的關鍵因素，而后者在控制炎癥方面發揮重要作用。故推測ERS相關蛋白XBP1可通過激活微小RNA-346來控制肝臟的炎癥，從而間接抑制HF的形成及發展。有報道指出[48]，ERS介導的微小RNA-30C-2*的表達直接參與了PERK通路對NF-κB的激活。而NF-κB與HF密切相關，故ERS可借助于微小RNA-30C-2*間接參與HF的發生發展。也有研究認為[49]：ERS可通過IRE1a調節微小RNA-150的降解及XBP1的剪切來促進纖維化形成，抑制IRE1 RNA酶可阻礙HSC直接轉化為纖維母細胞從而緩解HF。針對膽道梗阻小鼠模型研究發現[46]，微小RNA-29a過度表達可緩解膽道梗阻所致ERS而發揮抗HF作用。因此認為，ERS與部分微小RNA相互作用參與HF的發生發展。

4 展望

HF是一個由多種肝臟細胞、細胞因子、信號通路等參與的復雜病理過程。ERS作為一條重要的信號傳導通路與諸多疾病密切相關。本文闡述了ERS與HF發生發展及逆轉的關系，有助于進一步豐富HF機制，未來通過深入研究，ERS有望成為一個新的切入點，藉此尋找HF預防、診療及預后評估等新的靶點。