氣相色譜－串聯(lián)質譜法測定山藥中農藥殘留的一測多評研究

陳 嵐 ，余敏靈 ，楊 佳 ，梁 華 ，李 根

（1.四川省成都市婦女兒童中心醫(yī)院，四川 成都 610091； 2.四川省樂山市食品藥品檢驗檢測中心，四川 樂山 614000）

近年來，隨著中藥材的產業(yè)化發(fā)展，農藥污染問題日益嚴重，農藥殘留問題始終制約著中藥走向國際化。2015年版《中國藥典（四部）》收載了多種有機氯類、有機磷類等農藥殘留的氣相色譜檢查方法[1]。文獻中農藥殘留檢測方法多以氣相色譜（GC）法、液相色譜法、氣相色譜－質譜（MS）聯(lián)用及液相色譜－質譜聯(lián)用為主[2－8]，但都存在對照品獲得困難、操作煩瑣或多指標檢測成本高的問題。為此，本研究中應用氣相色譜－串聯(lián)質譜(GC－MS／MS)法，根據色譜保留時間和質荷比信息對樣品進行定性分析，以聯(lián)苯菊酯二級離子掃描色譜峰面積為參照，計算其與甲氰菊酯二級離子掃描色譜峰面積和溴氰菊酯二級離子掃描色譜峰面積的校正因子，建立GC－MS／MS法測定山藥[1]中聯(lián)苯菊酯等3種農藥殘留的一測多評方法，結果滿意，可為GS－MS／MS測定農藥殘留量提供一測多評[9－12]研究思路。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

GCMS－TQ8030型氣質聯(lián)用儀，Rxi－5SilMS型毛細管柱（30 m × 0.25 mm，0.25 μm），工作站為 LabSolutions GCMS Solutions（4.20 版，島津中國科技有限公司）；Cleanert TPH凈化柱（天津博納艾潔爾公司）。

1.2 試藥

聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯標準溶液（規(guī)格為100 μg／mL，批號分別為 GSB05－2333－2016，GSB05－2306－2016，GSB05－2310－2016）；乙腈、丙酮為色譜純，氯化鈉、無水硫酸鈉均為優(yōu)級純。山藥樣品采購于樂山中藥材有限公司，按2015年版《中國藥典（一部）》所載方法鑒定為薯蕷 Dioscorea opposita Thunb.的干燥根莖[13]，樣品批號分別為 20161001，20161002，20161003。

2 方法與結果

2.1 測定條件

2.1.1 氣相色譜條件

色譜柱：采用 Rxi－5SilMS型毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度：250 ℃ ；線速度：47.2 cm ／s；程序升溫：50 ℃保持 1 min，以 25 ℃ ／min 的速率升至125℃，再以10℃ ／min的速率升至300℃，保持15 min；進樣體積：1 μL；載氣：高純度氦氣（＞99.999%）。

2.1.2 質譜條件

離子源溫度：200℃；接口溫度：250℃；溶劑延遲時間：5 min；碰撞氣：氬氣（純度大于 99.999% ）；電離方式：見表 1。

表1 3種農藥的質譜電離方式

2.2 溶液制備

標準貯備溶液：精密量取聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯標準溶液各1 mL，置10 mL容量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻，作為標準貯備溶液（每1 mL含聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯各 10 μg）。

樣品溶液：取山藥（批號為20161001）約50 g，粉碎成粉末（過 3號篩），稱取粉末 1.023 1 g，精密稱定，置50mL離心管中，加入15 mL乙腈，以15000 r／min的速率勻漿提取1 min，加入2 g氯化鈉，再勻漿提取1 min，以4 200 r／min的速率離心5 min，取上清液置150 mL雞心瓶中，再向離心管中加入15 mL乙腈，按上述方法重復勻漿提取1次，合并提取液，于40℃水浴旋轉蒸發(fā)至約1 mL。Cleanert TPH固相萃取柱上加入約2 cm高無水硫酸鈉，用10 mL正己烷 －丙酮（6∶4）預洗后，將樣品濃縮液移入柱中，用 25 mL正己烷 －丙酮（6∶4）洗脫，收集洗脫液于40℃水浴旋轉濃縮至近干，用丙酮定容至 1 mL，0.2 μm 濾膜濾過，即得。

空白溶液：除稱取樣品粉末外，按上述操作制備空白溶液。

樣品加標溶液：稱取同一批(批號為20161001)山藥粉末1.031 0 g，精密稱定，按樣品溶液的制備方法，自“置50 mL離心管中”起到“收集洗脫液于40℃水浴旋轉濃縮至近干”，用丙酮轉移至1 mL容量瓶中，另取標準貯備溶液1 mL置10 mL容量瓶中，用丙酮稀釋至刻度，搖勻，精密量取此溶液5 μL置上述1 mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度，搖勻，用0.2 μm濾膜過濾，即得。

2.3 圖譜解析

精密量取標準貯備溶液 25 μL，置 5 mL容量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。按擬訂測定條件，取對照品溶液、樣品溶液、樣品加標溶液、空白溶液分別進樣，記錄色譜圖。結果見圖1和圖2。在對照品溶液二級離子掃描色譜圖中有聯(lián)苯菊酯（181.1 ／166.1，即母離子與子離子的 m ／z值之比，下同）、甲氰菊酯（265.1 ／210.1）和溴氰菊酯（252.9 ／93.0）色譜峰；保留時間，聯(lián)苯菊酯為17.514 min，甲氰菊酯為17.695 min，溴氰菊酯為 21.783 min；在空白溶液色譜圖和樣品溶液色譜圖中無上述色譜峰，在樣品加標溶液色譜圖中有和對照品溶液色譜圖中保留時間一致的聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯二級離子掃描色譜峰。對照品溶液和樣品加標溶液的二級離子碎片圖譜中，聯(lián)苯菊酯在 153.1，166.1，179.1 處（豐度比為 5 ∶100 ∶19，以166.1 為參比），甲氰菊酯在 89.0，172.1，210.1 處（豐度比為 40 ∶14 ∶100，以 210.1 為參比），溴氰菊酯在 77.0，93.0，171.9 處（豐度比為 22 ∶100 ∶84，以 93.0 為參比）均有二級離子碎片峰。

圖1 二級離子掃描色譜圖

2.4 方法學考察

線性關系考察：精密量取標準貯備溶液5，10，20，25，30，40，50 μL，分置 7 個 5 mL 容量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻。按擬訂測定條件進樣測定，以組分二級離子掃描（181.1 ／166.1）峰面積（A）對進樣量（m，ng）進行線性回歸，得回歸方程。結果見表2。

精密度試驗：精密量取標準貯備溶液 20 μL，置5 mL容量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻。按擬訂測定條件重復進樣6次。測定結果見表2。結果表明，儀器精密度好。

重復性試驗：精密量取標準貯備溶液20 μL，分別置6個5 mL容量瓶，加丙酮稀釋至刻度，搖勻。按擬訂測定條件分別進樣測定。結果見表2。可見，方法重復性好。

樣品溶液穩(wěn)定性試驗：取樣品加標溶液，按擬訂測定條件，分別在 0，2，4，8，12，14，16，20，24 h 時進樣。結果聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯二級離子掃描色譜峰面積變化不大，RSD 分別為 1.12% ，1.25% ，0.93%（n＝9），表明樣品溶液在24 h內穩(wěn)定。

檢出限與定量限確定：取樣品加標溶液，按擬訂測定條件進行測定，測得信噪比（S／N），以 S／N＝3計算最低檢出限，S／N＝10計算最低定量限。結果見表2。

回收率試驗：取2.2項下山藥粉末9份，分為3組，每組3份，每份約1 g，精密稱定，分置9個50 mL離心管中，每組分別加入標準貯備溶液 4，5，6 μL，依法制備樣品溶液，取樣品溶液，按擬訂測定條件分別進樣，記錄圖譜。按回歸方程 A＝10 388 461 m－236計算供試品中聯(lián)苯菊酯含量，按校正方程 A甲＝10388461 mf甲／聯(lián)－236計算甲氰菊酯含量，按校正方程 A溴＝10 388 461 mf溴／聯(lián)－236計算溴氰菊酯含量。結果見表3。

圖2 二級離子碎片圖譜

表2 線性關系考察、精密度、重復性及檢出限與定量限試驗結果

表3 加樣回收試驗結果（n＝9）

f值和 t值測定：甲氰菊酯與聯(lián)苯菊酯色譜峰峰面積的校正因子 f甲／聯(lián)＝523 142／10 388 461＝0.050 4，相對保留時間 t甲／聯(lián)＝17.695 ／17.514 ＝1.010 3；溴氰菊酯與聯(lián)苯菊酯色譜峰峰面積的校正因子 f溴／聯(lián)＝520 881／10 388 461＝0.050 1，相對保留時間 t溴／聯(lián)＝21.783 ／17.514 ＝ 1.243 7。

f值耐受性考察：實際應用中，色譜條件可能會有一些變化，故對線速度、進樣體積等可能影響 f值的因素進行考察，結果 f值的波動不大。詳見表4。

2.5 樣品中農藥殘留量測定

分別取3批山藥樣品約50 g，分別粉碎成粉末（過3號篩），分別取粉末約1 g，精密稱定，依法制備樣品溶液，取樣品溶液按擬訂測定條件分別進樣，記錄圖譜，計算樣品中聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯殘留量。結果見表5。

3 討論

以聯(lián)苯菊酯為對照品測定樣品中3種農藥殘留，其原理是利用樣品色譜圖中聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯的色譜峰相對保留時間進行定位[2]，以及二級離子碎片圖譜碎片離子峰和豐度比對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯色譜峰進行定性分析。定量分析，通過精密量取聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯對照品溶液各適量，配制成不同濃度的混合溶液，按設定條件進樣，記錄色譜圖，繪制進樣量對其峰面積的回歸曲線，以聯(lián)苯菊酯回歸曲線斜率與甲氰菊酯、溴氰菊酯回歸曲線斜率的比值計算校正因子（fsk＝Ks／Kk），通過聯(lián)苯菊酯回歸曲線計算聯(lián)苯菊酯含量，通過校正因子及聯(lián)苯菊酯回歸曲線計算甲氰菊酯、溴氰菊酯含量。

表4 相對校正因子耐受性考察結果

表5 3批樣品中3種農藥殘留量測定結果（ng／kg）

GC－MS聯(lián)用法和GC－MS／MS法既具有GC的高分離效能，又具有MS可鑒定化合物結構的特點，可同時快速測定樣品中多種殘留農藥及其衍生物。本研究中采用的一測多評法，通過設定1種對照品，建立該成分與其他成分間的相對響應因子，再用該因子計算其他成分含量。一測多評法具有成本低、效率高等優(yōu)點，能有效解決多指標質量控制面臨的對照品短缺、不易獲得、檢測成本相對昂貴和農藥對照品造成環(huán)境污染等問題，是較常用的一種質量控制方法。然而，中藥材往往含有多種成分，且其中某些成分可能對測定產生干擾。因此，使用一測多評法對中藥材殘留農藥進行含量測定，尤其在測定某一具體品種時應設計具體的試驗參數，并進行方法學驗證。

校正因子計算法常應用于化學藥中有關物質的測定，以及中藥材及其復方制劑中多指標成分的測定。校正因子的表示方法很多，本試驗中是指氣相色譜法的相對質量校正因子。測定時，可精密稱（量）取1個成分對照品和其他物質對照品各適量，分別配制成不同濃度的溶液，進樣，記錄色譜圖，繪制選定成分進樣量和其他成分進樣量對其峰面積的回歸曲線，以其回歸直線斜率之間的比值計算。

本試驗中采用乙腈提取，經Cleanert TPH專用凈化柱凈化，根據色譜相對保留時間和質荷比信息對樣品進行定性分析，以聯(lián)苯菊酯二級離子掃描峰面積為參照，成功建立了以聯(lián)苯菊酯為對照品測定山藥中聯(lián)苯菊酯等3種農藥殘留量的GC－MS／MS方法。一般而言，當色譜條件有細微改變時，相對保留時間有細微變化，故需考察該時間耐受性。本試驗中未作考察，是因為被測定物質的定性主要采用二級離子碎片峰及其豐度比確認；又因乙腈對農藥溶解度較大，可溶入的雜質量適中，故選擇乙腈為提取液。另外，本試驗中還在Cleanert TPH固相萃取柱上加入約2 cm高的無水硫酸鈉，以除去樣品溶液及洗脫液中的水分，從而充分凈化樣品，進一步保證檢測質量。

綜上所述，本研究中建立的一測多評法簡單，快速，定量準確，適用于山藥中聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯農藥殘留的測定。

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