高效液相色譜－二極管陣列檢測器法測定食用土當(dāng)歸總有機酸中貝殼杉烯酸及海松酸含量

黨凱茹 ，彭 騰 ，楊 菁 ，禹亞杰 ，匡 宇 ，韓 笑

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院·中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地·中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室，四川 成都 611137； 2.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002； 3.四川護理職業(yè)學(xué)院，四川 成都 611137）

食用土當(dāng)歸 Aralia cordata Thunb.是五加科 木屬植物的根及根莖，是商品九眼獨活的主流品種，其作藥用最早收載于《本草綱目》[1]，味辛、苦，性微溫，具有祛風(fēng)除濕、止痛利尿消腫的功效[2]。該藥為多年生草本，主產(chǎn)區(qū)為四川，阿壩、涼山、甘孜等州產(chǎn)量最大，陜西、湖北等地亦有分布，為藥食兩用的傳統(tǒng)中藥[3]。食用土當(dāng)歸總有機酸是從食用土當(dāng)歸的根及根莖中提取純化得到的提取物，課題組前期藥理試驗研究表明，該總有機酸為食用土當(dāng)歸抗炎鎮(zhèn)痛的有效成分[4]。總有機酸所含主要化學(xué)成分是貝殼杉烯酸、海松酸等二萜羧酸類，貝殼杉烯酸及海松酸為抗炎鎮(zhèn)痛的有效成分[5－6]。目前對食用土當(dāng)歸的研究較少，僅限于對其化學(xué)成分及藥理活性的研究，對食用土當(dāng)歸總有機酸的報道主要針對于其提取純化工藝和抗炎鎮(zhèn)痛藥效學(xué)方面，質(zhì)量控制方面的研究未見報道；此外，2015年版《中國藥典(一部)》未收載該藥，而2010年版《四川中藥材標(biāo)準(zhǔn)》也缺乏詳細而深入的研究，該藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基本還處于空白狀態(tài)。故本試驗中通過建立測定貝殼杉烯酸和海松酸含量的高效液相色譜－二極管陣列檢測器（HPLC－DAD）法，為食用土當(dāng)歸總有機酸的質(zhì)量控制提供參考，也為食用土當(dāng)歸藥材標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC－20AT型 HPLC儀，SPD－M20A型 DAD檢測器（日本島津公司）；BUG25－12型超聲清洗器（必能信超聲有限公司）；色譜柱為 YMC－Pack ODS－AQ柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；FA2004N 型電子天平（上海民怡儀器儀表有限公司）；BP121S型電子天平（德國Sartorius公司）；DZG－6020型真空干燥箱（上海信森實驗儀器有限公司）；DZKW－4型電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。

1.2 試藥

乙腈、甲醇均為色譜純（美國天地公司）；磷酸為分析純（成都科龍化工試劑廠）；優(yōu)普UPT系列超純水（成都優(yōu)普電子產(chǎn)品有限公司）；其他試劑均為分析純。

貝殼杉烯酸對照品、海松酸對照品（均為實驗室自制，HPLC儀檢測純度超過98%）；食用土當(dāng)歸 Aralia cordata Thunb.藥材購自四川省成都市荷花池中藥材市場，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院蔣桂華教授鑒定為五加科

木屬植物食用土當(dāng)歸 Aralia cordata Thunb.的根及根莖；食用土當(dāng)歸總有機酸（10批自制食用土當(dāng)歸藥材樣品，批號分別為 201301，201302，201303，…，201310，棕褐色稠膏狀）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

混合對照品溶液：稱取干燥至恒重的貝殼杉烯酸及海松酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL分別含 225.7 μg 和 283.9 μg 的混合對照品溶液。

食用土當(dāng)歸總有機酸[7]：取食用土當(dāng)歸粉末，加8倍量95%乙醇回流提取2次，每次1 h，抽濾，合并濾液，減壓濃縮干燥，得食用土當(dāng)歸乙醇提取物，乙醇提取物20倍量水溶解后，加NaCl使質(zhì)量分?jǐn)?shù)達0.50%，2倍量石油醚萃取4次，萃取液濃縮至乙醇提取物20倍量體積，再用1.0%KOH溶液等體積萃取3次，堿水層加濃鹽酸使 pH達1，加 NaCl使質(zhì)量分?jǐn)?shù)達0.50%，用等體積石油醚萃取3次，減壓回收石油醚，干燥，即得。

供試品溶液：取食用土當(dāng)歸總有機酸約25 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容至刻度，搖勻，即得。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：YMC－PackODS－AQ柱（250mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 － 0.1% 磷酸水溶液（76 ∶24）；檢測波長：202 nm；流速：1.0 mL ／min；柱溫：30 ℃；進樣量：15 μL。在上述色譜條件下分別取混合對照品溶液、供試品溶液自動進樣，記錄色譜圖（見圖1）。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 耐用性考察

色譜柱考察：按2.2項下色譜條件，考察了Phenomenex Luna C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），Agilent Eclipse plus C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），YMC －Pack ODS－AQ 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）3 種色譜柱對供試品中貝殼杉烯酸及海松酸的影響，結(jié)果見表1。可見，3種色譜柱均可用于食用土當(dāng)歸總有機酸的貝殼杉烯酸和海松酸的含量測定。

表1 色譜柱考察結(jié)果

流速考察：按 2.2項下色譜條件，以 YMC－Pack ODS－AQ 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，考察不同流速對供試品溶液中貝殼杉烯酸及海松酸含量的影響，結(jié)果見表 2。可見，流速在 0.8～1.2 mL ／min 時，測得含量的 RSD值小于3%，分離度也好，均可作為食用土當(dāng)歸總有機酸中貝殼杉烯酸和海松酸的含量測定用流速。

表2 流速考察結(jié)果

柱溫考察：按2.2項下色譜條件，考察不同柱溫對供試品溶液中貝殼杉烯酸及海松酸含量的影響，結(jié)果見表3。可見，柱溫在25～35℃之間時，RSD值均在3%以內(nèi)，分離度也好，均可作為食用土當(dāng)歸總有機酸中貝殼杉烯酸和海松酸的含量測定用柱溫。

表3 柱溫考察結(jié)果

2.4 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取混合對照品溶液自動進樣，分別進樣 10，12，14，16，18，20 μL，以進樣量(X)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得貝殼杉烯酸回歸方程為 Y＝1.6×106X ＋25 642（R2＝0.999 6，n＝6），海松酸 回 歸方程 為 Y＝1.6×106X－20 531（R2＝0.999 6，n＝6）。結(jié)果表明，貝殼杉烯酸對照品溶液進樣量在 2.257 ～ 4.514 μg，海松酸對照品溶液進樣量在2.839～5.678 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：按2.2項下色譜條件，精密吸取混合對照品溶液15 μL，連續(xù)進樣6次。結(jié)果貝殼杉烯酸和海松酸峰面積的 RSD分別為0.27%和0.25%(n＝6)，均小于3%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：精密吸取同一供試品溶液，于配制后0，4，8，12，16，24 h 時進樣 15 μL，測定貝殼杉烯酸和海松酸峰面積。結(jié)果的 RSD分別為 0.27%和 0.32%(n＝6)，均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：稱取食用土當(dāng)歸總有機酸（批號為201307）6份，每份約25 mg，精密稱定，依法制備供試品溶液，以 2.2項下色譜條件進樣 15 μL，測定。結(jié)果貝殼杉烯酸和海松酸平均含量分別為19.20%和27.43%，RSD 分別為 2.24% 和 1.34%(n＝6)，均小于 3% ，表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：稱取已知含量的同一批（批號為201307）食用土當(dāng)歸總有機酸6份，約12.5 mg，精密稱定，分別精密加入一定量混合對照品溶液，依法制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件進樣15 μL。結(jié)果見表4。

表4 貝殼杉烯酸與海松酸加樣回收試驗結(jié)果(n＝6)

2.5 樣品含量測定

分別稱取不同批號的食用土當(dāng)歸總有機酸，依法制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件進樣 15 μL，測定樣品中貝殼杉烯酸和海松酸的峰面積，按外標(biāo)一點法計算，結(jié)果見表5。

表5 樣品中貝殼杉烯酸和海松酸的含量測定結(jié)果（%，n＝10)

3 討論

食用土當(dāng)歸總有機酸中貝殼杉烯酸和海松酸的總平均含量為46.87%，表明提取純化后的總有機酸中仍可能含有脂肪酸等其他小分子酸。課題組今后可對其純化研究工藝進行進一步優(yōu)化，以期得到含量更高的總有機酸，完善以貝殼杉烯酸和海松酸為指標(biāo)的食用土當(dāng)歸總有機酸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，同時結(jié)合生產(chǎn)，實施工藝放大驗證，為食用土當(dāng)歸總有機酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。海松酸和貝殼杉烯酸均有抗炎鎮(zhèn)痛活性，且海松酸平均含量比貝殼杉烯平均含量高8.41%，由此可設(shè)想從2個單體成分在總有機酸中含量不同的角度，對各自的抗炎鎮(zhèn)痛活性程度進行對比研究。

本課題組前期采用正交試驗法對食用土當(dāng)歸中總有機酸的提取工藝參數(shù)進行優(yōu)選，同時采用有機溶劑萃取法與酸堿法相結(jié)合的方法，通過單因素試驗，從檢測器和流動相選擇上對總有機酸的純化工藝進行了優(yōu)選。檢測器比較發(fā)現(xiàn)，蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）所得的圖譜中只出現(xiàn)貝殼杉烯酸和海松酸2個峰，無法辨別是否已與其他雜質(zhì)峰分開；此外，ELSD檢測器的準(zhǔn)確度和重復(fù)性相對較差，故選擇DAD檢測器進行檢測，并參考文獻[8]對乙腈 －水（76 ∶24）、乙腈 －0.1%磷酸水（76∶24）、乙腈－0.2%磷酸水（76∶24）3種流動相進行了考察，結(jié)果表明，3種流動相均能達到較好分離，但與未加磷酸相比，加了磷酸后所得色譜圖的峰形更好，且考慮到色譜柱的使用壽命，故選擇酸度較低的乙腈－0.1%磷酸水溶液（76∶24）作為流動相。

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