重組紅細胞生成刺激蛋白單次皮下給藥耐受性、安全性及藥代動力學(xué)研究

吳全睿 ，戎 殳 ，梅長林 ，洪俊平 ，廖慶平

（1.沈陽三生制藥有限責(zé)任公司，北京 100101； 2.上海長征醫(yī)院腎內(nèi)科·解放軍腎臟病研究所，上海 200003）

促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）是由腎皮質(zhì)近曲小管周圍的間質(zhì)細胞或基底產(chǎn)生的一種糖蛋白激素，作用于骨髓中紅系造血祖細胞，促進其增殖、分化，調(diào)節(jié)和維持循環(huán)中紅細胞的生理水平。EPO的生物多效性已被大量研究所證實，在缺血－再灌注、炎癥、神經(jīng)保護、創(chuàng)傷愈合等多種動物模型中被廣泛研究[1－3]。局部產(chǎn)生的EPO通過與不同于介導(dǎo)紅細胞生成的EPO受體結(jié)合，激活多條細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，減少細胞的程序性死亡，減輕局部炎性反應(yīng)，發(fā)揮組織保護作用[4]?；蛑亟M人促紅細胞生成素（rHuEPO）含165個氨基酸，相對分子質(zhì)量約為38×103，與天然EPO的理化性質(zhì)和生物學(xué)作用基本一致[5]，已被廣泛用于治療各種原因所致的貧血，可減少輸血比例，改善患者預(yù)后，是治療慢性腎功能不全伴貧血的主要手段[6]。重組紅細胞生成刺激蛋白（rESP）注射液是由我國某制藥有限責(zé)任公司利用基因重組技術(shù)誘導(dǎo)EPO基因突變而制得的高糖基化長效重組蛋白產(chǎn)品。為探索該藥在健康人群中的耐受性、安全性、藥代動力學(xué)及藥物效應(yīng)學(xué)特征，該公司醫(yī)學(xué)部、上海長征醫(yī)院·解放軍腎臟病研究所聯(lián)合開展了Ⅰ期臨床試驗[臨床試驗批件號為2012L01721，醫(yī)學(xué)倫理委員會批件號為2101（倫審）－50]，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

儀器：VERSA Max Microplate Reader酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；ULT1386－3－V41型超低溫冰箱（－80～－60℃，美國 Thermo Scientific公司）；VORTEX－5型漩渦混合器（中國Qilinbeier公司）；E－centrifuge型掌式離心機（美國Wealteo公司）。

試藥：人重組紅細胞生成刺激蛋白注射液（CHO細胞，批號為 S201212001，規(guī)格為每支 1 mL ∶25 μg），人重組紅細胞生成刺激蛋白（批號為 QS－BP－RESP－002，質(zhì) 量 濃 度 為 0.745 g／L），rESP 原 液 （批 號 為20130101，質(zhì)量濃度為 0.701 g／L），兔抗 rESP 抗體（質(zhì)量濃 度 為 12.9 g／L，ProteinA 純 化 蛋白，批 號 為20120710），均由沈陽三生制藥有限責(zé)任公司提供；rHuEPO試劑盒（美國 R＆D Systems公司，批號為DEP00）；羊抗兔 IgG－Hrp（中杉金橋公司）；試驗中所用主要試劑均為分析純，用水均為超純水。

1.2 研究對象與分組

試驗前，所有受試者的生命體征檢查及心電圖、血尿常規(guī)和肝腎功能等實驗室檢查均在正常范圍；均為健康志愿者；均對本研究知情同意，簽署經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準的知情同意書后，參加本研究。詢問病史排除慢性疾病患者；排除對EPO、紅細胞生成刺激蛋白過敏者。本研究中選擇年齡18～40歲的健康受試者38例，在皮下給藥 0.10 ～3.00 μg／kg的劑量范圍內(nèi)共設(shè) 7 個劑量組（0.10，0.25，0.50，1.00，2.00，2.50，3.00 μg ／kg，每組受試者 3～6例）。其中男 29例，女 9例；平均年齡（26.1 ± 4.0）歲；平均體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為（21.4 ±1.4）kg ／m2。36 例受試者完成全部試驗（0.25 μg／kg 劑量組中 1例受試者撤回知情同意書；1.00 μg／kg劑量組中1例受試者因在篩選期檢測anti－rESP抗體陽性提前退出研究）?；颊咭话阗Y料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性，詳見表 1。

表1 受試者人口學(xué)特征與各組給藥情況

1.3 試驗方法

1.3.1 耐受性和安全性

采用單中心、開放性、劑量逐次增量法設(shè)計研究。試驗期間，禁煙酒及刺激性食物。根據(jù)《健康成年志愿者首次臨床試驗藥物最大推薦起始劑量的估算指導(dǎo)原則》(國食藥監(jiān)注[2012]122號)，確定本次耐受性試驗的起始劑量為 0.10 μg ／kg，依據(jù)費氏改良法遞增劑量[7]，從低劑量開始，逐漸增加，根據(jù)該劑量的耐受情況決定是否進行后續(xù)的耐受試驗。同時，參考此前的動物實驗結(jié)果，按健康成年志愿者首次臨床試驗藥物最大推薦起始劑量的估算指導(dǎo)原則，將最大試驗劑量設(shè)定為3.00 μg／kg。每例受試者入組后，單次皮下注射相應(yīng)劑量，密切關(guān)注其癥狀和體征，并監(jiān)測血、尿常規(guī)，凝血功能，肝、腎功能，心電圖，免疫原性等指標(biāo)，觀察時間為14 d，同時參考美國衛(wèi)生及公共服務(wù)部、美國國立衛(wèi)生研究院、美國國家癌癥研究所聯(lián)合發(fā)布的《常見不良反應(yīng)事件評價標(biāo)準（CTCAE）》(4.0 版)對不良事件進行分級。

在試驗過程中，受試者體內(nèi)是否產(chǎn)生anti－rESP抗體是重要的安全性評價指標(biāo)之一。利用間接酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法測定人血清中anti－rESP抗體及其滴度。參考2010年版《中國藥典（三部）》中《藥品質(zhì)量標(biāo)準分析方法驗證指導(dǎo)原則要求》[8]，以及美國食品藥物管理局 (FDA)《Guidance for Industry Assay Development for Immunogenicity Testing of Therapeutic Proteins》的原則要求，對該方法的特異性、耐用性和樣品穩(wěn)定性進行驗證。由于臨床試驗中尚未獲得rESP的陽性對照抗體，方法學(xué)驗證及實際樣本檢測中陽性對照抗體均為通過免疫兔獲得anti－rESP抗血清，純化獲得。

anti－rESP抗體檢測：采集受試者給藥前及給藥后第 14天的靜脈血各 2.5 mL，于 4℃、速率 3 000 r／min離心10 min，離心半徑9.65 cm，分離血清，置－80℃冰箱中保存，待測。將已知rESP蛋白結(jié)合在固相載體上，然后將不同梯度的待檢血清置包被板上形成抗原抗體復(fù)合物，再加入用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗IgG，使之形成一個酶標(biāo)二抗－抗rESP抗體復(fù)合物，洗去未參加反應(yīng)的物質(zhì)，加入底物，用酶標(biāo)儀測450 nm波長處的吸光度。將待檢樣品與健康人對照同稀釋度比較，大于或等于2.1倍判定為陽性，小于2.1倍判定為陰性。

1.3.2 藥代動力學(xué)研究

36例受試者正常飲食，根據(jù)分組，分別按照0.10，0.25，0.50，1.00，2.00，2.50，3.00 μg ／kg 單次皮下給藥，于給藥前及給藥后 2，4，8，10，12，24，36，48，72，96，120，144，168 h 由上肢靜脈取血各2.5 mL，室溫靜置 30 min后，于 4℃、轉(zhuǎn)速 3 000 r／min離心10 min，分離血清，置－80℃冰箱保存，待測。使用rHuEPO測定試劑盒，采用ELISA法檢測血清中rESP的濃度[9](基于抗原捕獲ELISA方法)。酶標(biāo)板用鼠抗EPO單克隆抗體包被，樣品與固定于酶標(biāo)板的抗體反應(yīng)，清洗去掉過量樣品，用兔抗rESP抗體孵育，清洗去掉過量的兔多抗，加入酶標(biāo)羊抗兔抗體孵育，清洗去掉過量的酶標(biāo)抗體，加入顯色液，在酶催化氧化的條件下，顯色液變色，加酸終止，溶液顏色與結(jié)合在rESP上的酶標(biāo)抗體量呈正相關(guān)，因此與樣品中rESP的量呈正相關(guān)。測量吸光度，繪制濃度－吸光度標(biāo)準曲線，未知樣品吸光度與標(biāo)準曲線比較，計算樣品中質(zhì)量濃度，利用softmax Pro 5.2軟件，用四參數(shù)法（4－PL）進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。

1.3.3 藥效學(xué)指標(biāo)監(jiān)測

36例受試者按照分組單次皮下給藥后常規(guī)飲食，采集給藥前及給藥后3，7，10，14 d的靜脈血樣，用血細胞自動化分析儀檢測藥效學(xué)指標(biāo)，包括網(wǎng)織紅細胞計數(shù)、網(wǎng)織紅細胞百分比、紅細胞計數(shù)和血紅蛋白水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

根據(jù)藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)，計算血清濃度時間曲線下面積（AUC）、清除率（CL）、分布容積（Vd）、消除半衰期（t1／2）、生物利用度等藥代動力學(xué)參數(shù)。采用冪函數(shù)模型進行藥代動力學(xué)線性分析。按國際慣例，對 AUC以80%～125%，Cmax以70%～143%為線性動力學(xué)特征的判斷區(qū)間。若計算所得的90%置信區(qū)間在判斷區(qū)間范圍內(nèi)，則認為其具有線性動力學(xué)特征；若相互交叉，則無法下結(jié)論；若彼此錯開，則認為具有非線性藥代動力學(xué)特征。藥代動力學(xué)計算采用DAS 2.0軟件，其他統(tǒng)計分析采用SAS 9.2統(tǒng)計軟件包。

2 結(jié)果

2.1 耐受性和安全性

所有受試者（包括1例撤回知情同意書和1例篩選期被檢測出anti－rESP抗體陽性而退出研究的受試者）均進行安全性與耐受性分析。共有20例（52.63%）發(fā)生了22例次不良事件。其中18例次為注射部位疼痛，嚴重程度均為1級，持續(xù)時間均低于30 min，未給予任何處理（1.00 μg／kg 劑量組 6 例次，2.00 μg ／kg 劑量組4 例次，2.50 μg／kg 劑量組 2 例次，3.00 μg／kg 劑量組6 例次）。0.25 μg／kg 組與 2.50 μg ／kg 組受試者各出現(xiàn)尿常規(guī)異常（前者為血尿，后者為蛋白尿）2例次，嚴重程度均為1級，但經(jīng)臨床判斷均與試驗藥物無關(guān)。所有受試者血清實驗室指標(biāo)、凝血功能、心電圖等均無異常變化。未出現(xiàn)任何3級以上不良事件及嚴重不良事件。除1例受試者篩選期 anti－rESP抗體陽性退出外，其他受試者試驗前后內(nèi)源性 anti－EPO抗體和anti－rESP抗體檢測均為陰性。最大耐受劑量最終確定為 3.00 μg ／kg。

2.2 血藥濃度檢測及抗體檢測的方法學(xué)驗證

2.2.1 rESP血藥濃度檢測方法學(xué)驗證

采用rHuEPO測定試劑盒對rESP血藥濃度進行測定，試劑盒說明書中對方法的特異性、標(biāo)準品的質(zhì)量濃度線性范圍（0.04 ～ 4.00 ng／mL 或 2.50 ～ 200.00 mIU ／mL）均有詳細的驗證數(shù)據(jù)，本研究開始前對該方法的準確性、精密度及穩(wěn)定性進行了驗證。

準確性：對血清中終質(zhì)量濃度分別為100 μg／mL，10 μg／mL，100 ng／mL 的 rESP 原液進行測定，回收率為 97.6% ～ 110.0% ，變異系數(shù)（CV）為 0.4% ～ 3.3% ，符合檢測要求。對5個稀釋度的供試品（血清中終質(zhì)量濃度為 100 μg ／mL，10 μg／mL，100 ng／mL，4 000 pg／mL，1 000 pg／mL）的板內(nèi)精密度、3個質(zhì)量濃度供試品（血清中終質(zhì)量濃度 100 μg ／mL，10 μg ／mL，100 ng ／mL）板間精密度進行考察，CV均＜15%。

樣品穩(wěn)定性：將穩(wěn)定性考察樣品室溫放置24 h（每4 h檢測1次），反復(fù)3個凍融循環(huán)，4℃1個月、－20℃和 －70 ℃ 3個月（分別于 15，30，60，90 d 檢測樣品濃度），回收率介于80% ～120%。結(jié)果表明，該方法的準確性、精密度及室溫、長期、反復(fù)凍融穩(wěn)定性均符合檢測要求，適用于rESP含量檢測。

2.2.2 anti－rESP 抗體檢測方法學(xué)驗證

專屬性考察中以稀釋液為溶劑稀釋抗體作為標(biāo)準條件，以不同濃度的健康人血清（1 ∶25，1 ∶125，1 ∶625，1∶3 125，1∶15 625）作為可能影響檢測值變化的因素，觀察抗體在不同溶液體系中檢測結(jié)果的變化，結(jié)果顯示稀釋度血清對結(jié)果判定無影響。耐用性－作用時間考察中，改變樣品及二抗的孵育時間并與標(biāo)準孵育時間檢測值比較。結(jié)果顯示，如樣品作用時間及二抗溫育時間短（樣品作用時間小于1.5 h，二抗溫育時間小于1 h）則影響檢測結(jié)果的判定。耐用性考察－樣品穩(wěn)定性考察中，室溫8 h，反復(fù)凍融3次，4℃1個月，－20℃，－70℃3個月結(jié)果均與0月結(jié)果判定一致。結(jié)果表明，該方法適用于rESP臨床試驗的抗體檢測。

2.3 藥代動力學(xué)

在所選 3 個劑量組（0.25，1.00，2.50 μg ／kg）中，各選至少5例受試者，rESP皮下注射在健康人體內(nèi)的吸收與消除過程基本符合線性動力學(xué)特征。3個劑量組的平均終末半衰期(t1／2z）、達峰時間（ tpeak）、平均駐留時間（MRT）均相近，表明皮下吸收過程不受rESP給藥劑量的影響。總體 MRT 和 t1／2z分別為 195.97 h 和 120.7 h。各劑 量 組 患 者 的 Cmax分 別 為 （0.445 ±0.099）μg／L、（2.482 ± 1.431）μg ／L 和（6.474 ± 1.347）μg ／L。詳見表2和圖1。藥物暴露量與劑量線性分析結(jié)果顯示，AUC隨皮下注射劑量依賴性升高，呈現(xiàn)出一定的線性關(guān)系。對于高劑量組，受試者最后一次采樣點（用藥后168 h）血藥濃度仍處于較高水平，提示本試驗未收集到完整的藥物代謝數(shù)據(jù)。詳見圖2。

2.4 藥效學(xué)指標(biāo)

單次皮下注射 rESP 0.10 ～3.00 μg／kg 后網(wǎng)織紅細胞的計數(shù)及其百分比亦逐漸升高，給藥后第7天達高峰，觀察期內(nèi)未回落至給藥前水平。詳見圖3和圖4。紅細胞和血紅蛋白亦呈漸進性升高。

3 討論

從臨床試驗前動物實驗到首次人類試驗過程中，起始劑量的選擇是試驗成功的重要因素，在預(yù)測治療和安全邊際方面起著重要作用。70%的新藥臨床試驗最大推薦起始劑量（MRSD）的選擇基于最敏感動物未觀察到的不良反應(yīng)劑量水平（NOAEL），也是CFDA指導(dǎo)原則中所推薦的主要方法[9]。依據(jù)該方法，本課題組將大鼠多次給藥 NOAEL換算為人體等效劑量的1／10[7](即 0.1 μg ／kg)作為起始劑量，充分保障了首次人體試驗受試者的安全。將臨床擬用劑量的數(shù)倍（實取6倍，3.00 μg ／kg）作為最大爬坡劑量，充分考慮了受試者的安全性并兼顧療效和將來臨床可能出現(xiàn)的情況[9]。試驗期間，所有受試者對rESP耐受良好，未出現(xiàn)任何非預(yù)期不良事件，最大耐受劑量為 3.00 μg ／kg。rESP 用藥相關(guān)不良事件均為注射部位疼痛，均出現(xiàn)于1.00 μg／kg以上劑量組中，提示注射部位疼痛與給藥劑量有一定關(guān)系。

表2 給藥后藥代動力學(xué)統(tǒng)計矩參數(shù)(±s)

表2 給藥后藥代動力學(xué)統(tǒng)計矩參數(shù)(±s)

組別t 1／2 z C m a x t m a x 0.2 5 g／k g組（n＝5）1.0 0 g／k g組（n＝5）2.0 0 g／k g組（n＝6）（h）1 2 0.5 ±3 6.5 1 0 8.1 ±2 4.3 1 3 3.5 ±5 0.3（ g ／L）0.4 4 5 ± 0.0 9 9 2.4 8 2 ± 1.4 3 1 6.4 7 4 ± 1.3 4 7（h）6 0.0 ±2 8.4 5 6.0 ±1 8.1 5 8.0 ±2 5.6 V z（L ／k g）0.4 7 0 ± 0.1 0 2 0.3 6 3 ± 0.1 3 8 0.2 5 7 ± 0.0 6 4 C L z（L·k g ／h）0.0 0 3 ±0.0 0 1 0.0 0 2 ±0.0 0 1 0.0 0 2 ±0.0 0 1 A U C 0－t（ g·h ／L）5 1.9 ± 1 0.0 3 0 1.4 ± 1 4 9.5 7 9 6.4 ± 1 0 6.8 A U C 0－∞（ g·h ／L）9 3.0 ±2 2.7 4 9 0.9 ±2 0 1.0 1 4 7 0.3 ± 3 3 7.8 M R T 0－t（h）8 2.4 ± 7.6 8 2.2 ± 4.5 8 2.0 ± 5.5 M R T 0－∞（h）1 9 7.8 ±5 5.8 1 7 8.6 ±3 7.4 2 1 1.5 ±7 3.2

圖1 不同劑量給藥受試藥物的血藥濃度－時間曲線

圖2 rESP給藥劑量與 AUC0－∞的關(guān)系

圖3 rESP對網(wǎng)織紅細胞計數(shù)的影響

圖4 rESP對網(wǎng)織紅細胞百分比的影響

本研究中，16例受試者尿常規(guī)由正常轉(zhuǎn)異常，但均判定為異常無臨床意義，提示本試驗藥物對腎功能并無顯著影響。自1993年首次報道[9]以來，EPO抗體純紅細胞再生障礙性貧血（PRCA）一直是醫(yī)師關(guān)注的焦點。由于rHuEPO使用的途徑不同，發(fā)生機制不同，皮下注射比靜脈注射更易誘發(fā)PRCA，其導(dǎo)致的PRCA比終末期腎病引起的貧血更嚴重[10]。所有受試者給藥后14 d內(nèi)源性EPO抗體和rESP抗體檢測均為陰性，提示rESP對人體免疫系統(tǒng)的影響較小。但由于本試驗樣本量較小，隨訪時間短，今后仍需大樣本、長周期地隨訪觀察，以進一步明確本試驗藥物的免疫原性。1例受試者篩選期rESP抗體陽性，提示部分人群中可能存在rESP的天然抗體。

目前，已上市的常規(guī)rhEPO半衰期較短，通常只有4～8 h[11－12]，每周需要給藥 2～3次，以保證患者血紅蛋白水平相對穩(wěn)定，但嚴重影響了患者的依從性，增加了注射部位的感染概率。因此，近年來國內(nèi)外也開發(fā)了一系列延長EPO半衰期的藥物，主要有長效紅細胞生成刺激蛋白（NESP）和聚乙二醇（PEG）－EPO 等。NESP在國外已上市，但在國內(nèi)還未上市，PEG－EPO多處于臨床前開發(fā)階段。在 0.10 ～ 3.00 μg／kg 的給藥劑量范圍內(nèi)，rESP皮下吸收過程不受rESP給藥劑量的影響，在健康人體內(nèi)的吸收和消除過程基本符合線性動力學(xué)特征。皮下給藥后，吸收緩慢，其達峰時間長達60 h，顯著長于本品動物實驗中的 8～12 h，是 rHuEPO（12 h）的5～8倍[11]，也顯著長于NESP在中國血液透析人群中的 0.5 h[12]。消除過程同樣緩慢，終末半衰期（ t1／2z）長達100～130 h，是動物實驗值（29 ± 5）h的 4倍，是常規(guī)rHuEPO 的 15 ～ 20 倍[9－10]，也顯著長于 NESP（25.1 ～48.8 h）[13－14]。MRT 是目前常規(guī) rHuEPO 的 6 倍[10－11]，AUC0－t與同等給藥劑量的 NESP 相近[12－13]。藥物暴露量與劑量線性分析結(jié)果顯示，AUC隨皮下注射劑量依賴性升高，呈一定的線性關(guān)系。

皮下注射rESP后網(wǎng)織紅細胞的計數(shù)及其百分比呈劑量依賴性升高，第7天達高峰，觀察期內(nèi)升高的網(wǎng)織紅細胞大部分未回落至給藥前水平。紅細胞等呈漸進性升高，末次隨訪時（給藥后14 d）略高于篩選期。造成該現(xiàn)象的原因是由于紅細胞生長周期較長，網(wǎng)織紅細胞的數(shù)量變化早于紅細胞數(shù)量及血紅蛋白水平的變化。上述現(xiàn)象均與目前常規(guī)rHuEPO的臨床表現(xiàn)相似[8－9，14]。

綜上所述，rESP 在 0.10～3.00 μg／kg范圍內(nèi)皮下給藥具有很好的耐受性和安全性，與rHuEPO療效相似，在體內(nèi)滯留時間顯著延長，是rHuEPO很好的升級換代產(chǎn)品。但該研究也存在不足，如樣本量較小，觀察藥效學(xué)指標(biāo)較少等，需進一步研究。

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