水產(chǎn)飼料中細(xì)菌總數(shù)測(cè)量不確定度的評(píng)定

饒秋華，劉蘭英，何肖云

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所 350003)

根據(jù)國(guó)家飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[6]的規(guī)定，魚粉細(xì)菌總數(shù)的允許量為<2×106個(gè)(每克產(chǎn)品)，限量飼用為 (2～5)×106個(gè)，禁止使用的細(xì)菌總數(shù)為>5×106個(gè)。因此，細(xì)菌總數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果是衡量水產(chǎn)飼料產(chǎn)品合格與否的依據(jù)之一。一直以來(lái)，檢測(cè)機(jī)構(gòu)是以檢測(cè)值與限量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較來(lái)判定的，該方式對(duì)檢測(cè)值位于限量標(biāo)準(zhǔn)左右的產(chǎn)品來(lái)說(shuō)既不科學(xué)也不公正。目前我國(guó)參照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)制定和使用的《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》[1]標(biāo)準(zhǔn)，明確要求實(shí)驗(yàn)室出具的檢測(cè)報(bào)告應(yīng)包含相關(guān)評(píng)定校準(zhǔn)或測(cè)試結(jié)果的不確定度說(shuō)明。盡管在細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)中有諸多因素影響測(cè)量結(jié)果，例如培養(yǎng)條件、取樣、重復(fù)性和樣品保存條件等[2]，但只要在標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，樣品中細(xì)菌總數(shù)的檢測(cè)結(jié)果的不確定度主要取決于細(xì)菌分布的均勻性，表現(xiàn)為測(cè)量的重復(fù)性?，F(xiàn)按《 飼料中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定》[3]的方法，對(duì)20個(gè)水產(chǎn)飼料樣品細(xì)菌總數(shù)的測(cè)試結(jié)果進(jìn)行不確定度評(píng)定的實(shí)驗(yàn)過(guò)程與結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 檢測(cè)樣品

20份送檢的水產(chǎn)飼料樣品。

1.2 儀器與耗材

恒溫生化培養(yǎng)箱(30±1)℃、恒溫水浴鍋(46±1)℃、電子天平、振蕩器、全自動(dòng)高壓滅菌器、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、移液槍、吸嘴、三角瓶、培養(yǎng)皿。

1.3 檢測(cè)過(guò)程

依據(jù)飼料中細(xì)菌總數(shù)測(cè)定的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《 飼料中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定》[3]和食品菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)操作程序《2015 國(guó)家食品污染和有害因素風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作手冊(cè) 》[4]，用平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)，具體操作步驟：在無(wú)菌操作條件下稱取水產(chǎn)飼料樣品25.0 g，放入含有225 mL滅菌生理鹽水的無(wú)菌三角瓶中，置振蕩器上充分振蕩30 min后，制成1∶10的均勻稀釋液；用1 mL滅菌吸管吸取1∶10稀釋液1 mL，沿管壁慢慢注入含有9 mL滅菌生理鹽水的試管中，放微型混合器上混合30 s，配制成1∶100稀釋液；取1 mL滅菌吸管按上述操作順序，配制10倍遞增稀釋液，如此每稀釋一次更換一支1 mL滅菌吸管。

根據(jù)飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求和對(duì)樣品污染程度的評(píng)估，本檢測(cè)室選取1×10-2、1×10-3、1×10-4三個(gè)稀釋度。在作10倍遞增稀釋的同時(shí)，以吸管移取1 mL稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做2個(gè)培養(yǎng)皿。稀釋液移入培養(yǎng)皿后，應(yīng)及時(shí)將冷卻至(46±1)℃的培養(yǎng)基注入培養(yǎng)皿，每皿約15 mL，小心轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使試樣與培養(yǎng)基充分混合，從稀釋樣到傾注培養(yǎng)基的時(shí)間不能超過(guò)30 min； 待瓊脂完全凝固后，倒置平皿于(30±1)℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(72±3)h。

1.4 菌落計(jì)數(shù)

2次平行檢測(cè)的細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)結(jié)果分別計(jì)為A1和A2，飼料樣品中的細(xì)菌總數(shù)A按下式計(jì)算：

式中：n為樣品溶液用 0.85%無(wú)菌生理鹽水稀釋的倍數(shù)。

1.5 不確定度的評(píng)估方法

對(duì)樣品細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，通常對(duì)每份樣品做2個(gè)重復(fù)檢測(cè)，以平均值結(jié)果出具報(bào)告，如果單憑2個(gè)數(shù)據(jù)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差顯然是不準(zhǔn)確的。為了對(duì)具有較大的自由度的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行計(jì)算，TELARC(新西蘭實(shí)驗(yàn)認(rèn)證組織的簡(jiǎn)稱)提出一種方法：用細(xì)菌總數(shù)的對(duì)數(shù)計(jì)算合并樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差[5]。《化學(xué)分析方法中不確定度的評(píng)估指南》(中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委的認(rèn)可文件)的實(shí)例中詳細(xì)介紹了計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化差值標(biāo)準(zhǔn)偏差的方法。本研究參考該方法，同時(shí)作了以下的修改：在計(jì)算中用殘差代替差值。為了與對(duì)數(shù)值計(jì)算方法(TELARC法)的結(jié)果作比較，利用原始數(shù)據(jù)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化殘差標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)結(jié)果

表1 水產(chǎn)飼料樣品中細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)結(jié)果

20 組樣品細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，包括檢測(cè)原始數(shù)據(jù)、每組數(shù)據(jù)的平均值、殘差和標(biāo)準(zhǔn)化殘差(殘差除以平均值)。用貝塞爾公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化殘差的標(biāo)準(zhǔn)差，所得結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)化殘差標(biāo)準(zhǔn)差，即單次測(cè)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差是總的隨機(jī)變化的度量指標(biāo)。

2.2 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.3 擴(kuò)展不確定度

取包含因子k=2、置信水平約為95%，擴(kuò)展不確定度為：

UREL(A)=kUrel(A)=2×0.0624=0.12

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)采用合并樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差的方法評(píng)定20個(gè)送檢樣品細(xì)菌總數(shù)的擴(kuò)展不確定度為0.12。當(dāng)檢測(cè)結(jié)果以2次測(cè)定對(duì)數(shù)值的平均值表示時(shí)，其取值于lgA±0.12之間。

本試驗(yàn)采用的計(jì)算方法與TELARC法在本質(zhì)上是相同的，因?yàn)閮烧叨际菣z測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，其差別僅表現(xiàn)為本例未將殘差進(jìn)行平方，而是以殘差除以檢測(cè)平均值得到標(biāo)準(zhǔn)化殘差，本例所采用的標(biāo)準(zhǔn)化殘差標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算方法更簡(jiǎn)單便捷。

[1]劉安平，齊曉，喬?hào)|，等.GB/T 27025-2008/ISO/IEC 17025：2005，檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[2]朱勇.食品中菌落總數(shù)測(cè)定不確定度評(píng)定的應(yīng)用[J].中國(guó)衛(wèi)生產(chǎn)業(yè),2017(18)：41-44.

[3]李麗蓓，饒正華，楊曙明，等.GB/T 13093-2006，飼料中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007.

[4]楊大進(jìn)，李寧.2015年國(guó)家食品污染和有害因素風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)(菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)操作程序)[S].北京：中國(guó)質(zhì)檢出版社，2010.

[5]趙宏，趙化冰，張宏偉，等.PetrifilmTM測(cè)試片法在水產(chǎn)品細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)中不確定度的評(píng)定[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2009，30(6)： 133-138.

[6]姚繼承，艾地云，楊林，等.GB 13078-2001，飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2001.