青藏高原芽胞桿菌資源的收集與保存

陳 崢，劉 波，朱育菁，潘志針，劉 欣，劉丹瑩

(福建省農業科學院農業生物資源研究所 350003)

青藏高原包括藏北高原、藏南谷地、柴達木盆地、祁連山地、青海高原和川藏山峽谷區等，被譽為地球“第三極”和“世界屋脊”，是地學、生物學、資源與環境等研究領域的重點地區和天然實驗室。福建省農業科學院芽胞桿菌研究團隊(以下簡稱“研究團隊”)加入由中國科學院微生物研究所組織的青藏高原聯合科考隊，在國內首次系統開展青藏高原芽胞桿菌資源的采集、分離和鑒定工作。2013-2016年研究團隊系統開展了青藏高原芽胞桿菌資源考察，收集了海拔500～5100 m的高原荒漠、峽谷、草甸、溫帶森林、亞熱帶雨林、熱帶雨林等生境下的芽胞桿菌資源，系統調查青藏高原極端環境條件下存活的芽胞桿菌資源情況，通過菌株分離篩選與科學鑒定，發現未見報道的新種，進行功能開發利用；并建立起青藏高原芽胞桿菌資源名目與資源庫，完善中國芽胞桿菌分類體系。

研究團隊與中國科學院微生物研究所合作開展“青藏高原及新疆地區特色微生物資源與多樣性調查”項目的研究。自2013年以來，研究團隊系統開展了青藏高原地區芽胞桿菌資源采集工作，包括青藏野外科學考察芽胞桿菌資源采集、川青野外科學考察芽胞桿菌資源采集、川滇野外科學考察芽胞桿菌資源采集、青甘野外科學考察芽胞桿菌資源采集、川藏野外科學考察芽胞桿菌資源采集等。采集和分離到的青藏高原芽胞桿菌菌株保存于青藏高原芽胞桿菌資源庫，截至2017年3月共保存資源載體(主要是土壤)2827份，分離菌株8532株，其中初步鑒定菌株811株、疑似新種43個。

1 青藏高原芽胞桿菌樣品采集路線

研究團隊于2013-2016年進行連續4年的樣品采集，具體的采集路線及入庫樣品數歸納于表1。

1.1 2013年青藏高原芽胞桿菌資源調查與采集

設計3條采集路線，一是西藏羌塘地區，途經納木錯、雙湖、尼瑪、申扎、墨竹工卡、林芝等地，共采集土壤樣品268份；二是四川阿壩-青海班瑪地區，途經九寨溝、松潘、阿壩、斑瑪、色達、道孚、康定、瀘定等地，共采集土壤樣品263份；三是青海可可西里，途經互助北山、尕海湖、德令哈、青海湖、可可西里等地，共收集土壤樣品384份。

1.2 2014年青藏高原芽胞桿菌資源調查與采集

設計2條采集路線，一是川滇地區，途經洱源、麗江、香格里拉、白茫雪山、稻城、理塘、新都橋、康定等地，共采集土壤樣品509份；二是西藏林芝地區，途經林芝、魯朗、波密、通麥、墨脫、德行、察隅等地，共采集土壤樣品131份。

1.3 2015年青藏高原芽胞桿菌資源調查與采集

設計2條采集路線，一是青甘地區，途經互助林場、孟達天池、祁連山、大黑溝等地，共采集土壤樣品902份；二是西藏山南地區，途經林芝、山南、日喀則等地，共采集土壤樣品194份。

1.4 2016年青藏高原芽胞桿菌資源調查與采集

參加川藏地區318路線采集，途經理塘、亞丁、雅江等地，共采集土壤樣品176份。

表1 青藏高原芽胞桿菌樣品采集路線與土壤樣品數量

2 土壤樣品分布

2.1 地理分布

研究團隊從青藏高原6個地理板塊中采集了豐富的土壤樣品，其中來自祁連山地的土壤樣品最多，為902份；其次是來自川藏山峽谷區的土壤樣品，為872份；而青海高原、藏北高原和藏南谷地的土壤樣品分別為384份、268份和325份；來自柴達木盆地的樣品最少，為76份(表2)。

2.2 海拔分布

在青藏高原采集的土壤資源中，土壤樣品的海拔分布以海拔2900～3200 m的樣品最多，為604份，占總數的21.37 %；其次為海拔3300～3600 m的樣品，為522份，占樣品總數的18.46%；極端海拔(5000～5100 m)的樣品有34份，海拔低于2200 m的樣品有153份，分別占樣品總數的1.20%和5.41%(表3)。采集生境包括：高原荒漠、高山森林灌叢、峽谷區、草甸、森林、溫帶森林、濕地、亞熱帶雨林、熱帶雨林等(圖1-4)。

表2 土壤樣品的地理分布

注：*青藏高原地理特征參考百度百科中“青藏高原”“藏北高原”“藏南谷地”“青海高原”等詞條。

3 芽胞桿菌菌株保存與信息存檔

3.1 芽胞桿菌菌株信息存檔

對所采集土壤樣品中的芽胞桿菌進行分離和保藏，并參照劉國紅等[1]的方法，用16S rRNA進行初步鑒定。純化后的芽胞桿菌菌株，按研究團隊制定的條形碼格式進行編號，而后通過微生物菌落拍照儀進行拍照，獲得每株芽胞桿菌的菌落形態照片。其中，芽胞桿菌菌株信息(表4)包含了土樣的入庫編號、采集地點、生境類型、植被類型、經緯度、海拔、采樣時間及采樣人等。

3.2 芽胞桿菌菌株保存

表3 青藏高原土壤樣品的海拔分布

表4 青藏高原芽胞桿菌資源主要信息

圖1 草原草甸采集生境 圖2 峽谷采集生境

圖3 樹林采集生境 圖4 湖泊采集生境

圖5 菌株超低溫冰箱保存 圖6 芽胞桿菌菌株保存

獲得菌株編號后，采用-80℃甘油冷凍法進行保存(圖5)。甘油和保存培養基按1∶4的比例配好后，進行高壓滅菌20 min(圖6)。

4 討論

青藏高原是中國最大、世界海拔最高的高原，具有獨特的地理位置和氣候條件。目前針對青藏高原微生物多樣性的研究主要集中在冰川凍土[2]、高寒草甸[3]、高原湖泊[4]等，而針對青藏高原芽胞桿菌的系統調查與研究，還未見報道。福建省農業科學院芽胞桿菌研究團隊首次開展青藏高原芽胞桿菌資源考察，構建了青藏高原芽胞桿菌資源庫。截至2017年3月，該資源庫入庫資源載體2827份，芽胞桿菌菌株8532株。并鑒定菌株811株，發現疑似新種43個。該研究為進一步系統查明青藏高原極端條件下存活的芽胞桿資源狀況，發現未見報道的新種，建立起青藏高原芽胞桿菌資源名目與資源庫，為完善中國芽胞桿菌分類體系奠定了基礎。

[1]劉國紅,劉波,陳倩倩,等.西藏尼瑪縣鹽堿地嗜堿芽胞桿菌資源采集與鑒定[J].福建農業學報,2016,31(3):268-272.

[2]邢婷婷,劉勇勤,王寧練,等.青藏高原木孜塔格冰川、玉珠峰冰川及扎當冰川可培養細菌的生理特征[J].冰川凍土,2016,38(2):528-538.

[3]于健龍,石紅霄.高寒草甸不同退化程度土壤微生物數量變化及影響因子[J].西北農業學報,2011,20(11):77-81.

[4]張紅光,李琳,趙燕,等.青藏高原不同海拔湖水中可培養微生物的季節性變化[J].中獸醫醫藥雜志,2013,32(3):49-55.

[5]劉波.芽胞桿菌 第一卷 中國芽胞桿菌研究進展[M].北京：科學出版社,2015.

[6]劉波.芽胞桿菌 第二卷 芽胞桿菌分類學[M].北京：科學出版社,2016.

[7]劉波.芽胞桿菌.第三卷 芽胞桿菌生物學[M].北京：科學出版社,2016.

[8]劉波,王階平,陶天申,等.芽胞桿菌屬及其近緣屬種名目錄[J].福建農業學報,2015(1):38-59.