探討APC基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)及其在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的意義

摘要：目的 研究與分析腺瘤性結(jié)腸息肉病基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化表現(xiàn)狀態(tài)及其在宮頸癌中發(fā)生及發(fā)展的作用及意義。方法 選取本院所收治的120例宮頸鱗癌患者及30例正常宮頸上皮組織進(jìn)行研究，并采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)其組織中腺瘤性結(jié)腸息肉病基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，分析并比較。結(jié)果 經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，30例正常宮頸上皮組織中未檢測(cè)到腺瘤性結(jié)腸息肉病基因甲基化片段，而宮頸癌組織中，其腺瘤性結(jié)腸息肉病基因甲基化陽(yáng)性率為65.0%（78/120）；兩組陽(yáng)性率比較（P<0.05）。宮頸癌組織中，其不同臨床分期間腺瘤性結(jié)腸息肉病基因甲基化陽(yáng)性率比較（P<0.05）；而不同組織學(xué)分級(jí)和是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間腺瘤性結(jié)腸息肉病基因甲基化陽(yáng)性率比較（P>0.05）。結(jié)論 宮頸癌形成過(guò)程中，腺瘤性結(jié)腸息肉病基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化是早期且較為頻繁發(fā)生的事件，因此，其可能參與到宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展中，進(jìn)而為臨床疾病診斷及預(yù)后判斷提供重要的參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞：腺瘤性結(jié)腸息肉病；宮頸癌；基因；甲基化

腺瘤性結(jié)腸息肉病（Adenomatous polyposis coli；APC）基因是人體中一種重要抑癌基因[1]。經(jīng)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[2]，腺瘤性結(jié)腸息肉病基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化變化與多種惡性腫瘤存在緊密聯(lián)系。然其甲基化變化與宮頸癌間的相關(guān)性研究報(bào)道較少[3]。本次研究采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)宮頸癌及正常宮頸組織中腺瘤性結(jié)腸息肉病基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)情況，以探討與分析腺瘤性結(jié)腸息肉病基因與宮頸癌發(fā)生及發(fā)展的相關(guān)性，為臨床診斷及預(yù)防宮頸癌提供重要參考依據(jù)，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取貴陽(yáng)市婦幼保健院婦科2011年6月～2014年10月所收治的120例宮頸鱗癌患者及30例正常宮頸上皮組織進(jìn)行研究，本次研究標(biāo)本均為手術(shù)切除或門診活檢所得新鮮標(biāo)本。且所有組織均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)，研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者自愿參與研究且簽署知情同意書。術(shù)前未采用任何方式對(duì)患者進(jìn)行治療，患者術(shù)后資料完整，精神正常，可配合進(jìn)行研究。宮頸癌組織中，年齡27～68歲，平均為（46.5±1.0）歲；臨床分期：I期54例、II期48例、III期+IV期18例；組織學(xué)分級(jí)：G1～G2為78例、G3為42例；病理類型均為宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者為26例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者為94例。正常宮頸上皮組織中，年齡22～65歲，平均為（44.0±1.0）歲。

1.2方法 本次研究的新鮮組織在離體后立即放入液氮速凍，并轉(zhuǎn)入到-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｔ噭悍印roteinase K（Merck）、Taq DNA聚合酶、氯仿（Sigma）、dNTP、W izard DNA純化試劑盒（Genmed）、引物合成（上海生工）[4]。基因序列：APC甲基化：5-'TATTGCGGAGTGCGGGTC-3'、5-'TCGACGAACTCCCGACGA-3'；長(zhǎng)度為98bp。APC非甲基化：5-'GTGTTTTATTGTGGAGTGTGGGTT-3'、5-'CCAATCAACAAACTCCCAACAA-3'；長(zhǎng)度為108bp。DNA提取：選取新鮮組織100mg于液氮中碾碎，并采用蛋白酶K消化和苯酚-氯仿法進(jìn)行抽取，同時(shí)采用乙醇沉淀法提取組織中DNA，最后采用TE緩沖液進(jìn)行稀釋、溶解，再采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度及純度，并放置于-20℃冰箱中保存以備用[5]。DNA的亞硫酸氫鹽修飾：取2ugDNA放置于EP管中，然后加入雙蒸水進(jìn)行稀釋到50ul，并加入5.5ul新鮮配制的3.0mmol/L氫氧化鈉溶液，并搖勻，放置于37℃水浴中恒溫12min，再加入10mmol/L對(duì)苯二酚30ul、3.6mol/L亞硫酸鈉520ul，避光并混勻，待混勻后通過(guò)純化柱。使用W izard DNA純化回收系統(tǒng)提純DNA，加5.5ul新鮮配制的3mmol/L氫氧化鈉溶液，于37℃水浴中恒溫12min，再加入5mmol/L醋酸銨41ul，再使用無(wú)水乙醇沉淀DNA，并加入20ul雙蒸水進(jìn)行溶解，并放置于-20℃冰箱中保存以備用。MSP反應(yīng)：PCR反應(yīng)體系（25ul）：10×PCR buffer 25.0ul 2.5mmol/LdNTP混合物4.0ulMgCL2、4.0ulTaq酶0.2ul。引物分別為1ul，模板DNA2ul；去離子水補(bǔ)齊到25ul。反應(yīng)條件：95℃環(huán)境下預(yù)變性9min，95℃變性30s，退火[APC（M）：55℃、APC（U）：62℃]1min，72℃延伸30s，循環(huán)37次。72℃延伸5min，產(chǎn)物4℃保存。取10ul PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并采用凝膠成像分析儀來(lái)采集圖像。

1.3結(jié)果判斷 甲基化引物擴(kuò)增出現(xiàn)條帶，則判定為甲基化陽(yáng)性；非甲基化引物擴(kuò)增出現(xiàn)條帶，而甲基化未擴(kuò)增出條帶，則判定為甲基化陰性。甲基化與非甲基化引物均擴(kuò)增出現(xiàn)條帶，則判定為部分甲基化。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS20.0軟件統(tǒng)計(jì)與分析，計(jì)數(shù)資料采用[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)。結(jié)果以P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1甲基化情況 經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，30例正常宮頸上皮組織中未檢測(cè)到腺瘤性結(jié)腸息肉病基因甲基化片段，而宮頸癌組織中，其腺瘤性結(jié)腸息肉病基因甲基化陽(yáng)性率為65.0%（78/120）；2組陽(yáng)性率比較（χ2=20.41，P<0.05）。見圖1。

圖1 不同宮頸組織中APC基因甲基化情況；A：正常宮頸上皮組織；B、C：宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌

2.2 APC基因甲基化與宮頸癌臨床病理因素間關(guān)系 臨床分期：I期54例、II期48例、III期+IV期18例；宮頸癌組織中，其臨床分期間腺瘤性結(jié)腸息肉病基因甲基化陽(yáng)性率分別為74.1%（40/54）、45.8%（22/48）、88.9%（16/18）比較（P<0.05）；組織學(xué)分級(jí)：G1～G2為78例、G3為42例；而組織學(xué)分級(jí)陽(yáng)性率分別為59.0%（46/78）、76.2%（32/42），2者比較（χ2=1.79，P>0.05）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性率分別為53.9%（14/26）、45.7%（43/94），兩者比較（χ2=1.57，P>0.05）。見表1。

3 討論

臨床上，大部分宮頸癌為鱗狀細(xì)胞癌，同時(shí)其也是婦科女性人群中常見癌癥死亡原因。經(jīng)相關(guān)分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，大約90%左右的宮頸癌患者伴有HPV感染，但大多數(shù)HPV感染患者并不會(huì)發(fā)展為宮頸癌，因此HPV感染為單一因素，其不足以導(dǎo)致人類宮頸正常細(xì)胞發(fā)生癌變。DNA甲基化是最早所發(fā)現(xiàn)的基因轉(zhuǎn)錄前調(diào)控途徑之一。然在真核生物基因組中，大約有80%CpG位點(diǎn)被甲基化，且這些甲基化主要發(fā)生于基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島。經(jīng)相關(guān)研究表明，DNA甲基化可導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和DNA構(gòu)象及DNA穩(wěn)定性、DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式發(fā)生變化，自身或結(jié)合甲基結(jié)合蛋白后，其將阻遏轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合，最終可有效調(diào)控基因表達(dá)，同時(shí)其也是表觀遺傳學(xué)修飾最重要的基因轉(zhuǎn)錄前調(diào)控方式。抑癌基因的啟動(dòng)子甲基化與某些腫瘤的臨床分期與病理類型存在緊密聯(lián)系，同時(shí)其也成為腫瘤分子診斷及預(yù)后判斷的重要生物標(biāo)志物。基因啟動(dòng)子甲基化作為基因水平的標(biāo)志物，其具有極高特異性和靈敏度。近年來(lái)，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞甲基化水平發(fā)生極大變化，且在腫瘤發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中，時(shí)常出現(xiàn)整個(gè)基因組DNA的低甲基化和CpG島局部高甲基化。DNA的低甲基化往往因腫瘤細(xì)胞中DNA甲基化酶活性增高或CpG島的局部保護(hù)機(jī)制受到破壞而引起，最終導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定及原癌基因過(guò)度表達(dá)。而CpG島局部高甲基化常常會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡基因和細(xì)胞周期調(diào)控基因及血管生成基因等癌相關(guān)基因的沉默，最終導(dǎo)致發(fā)生癌癥。

Wnt信號(hào)通路異常與多種腫瘤發(fā)生存在緊密聯(lián)系，其參與多種腫瘤發(fā)生的機(jī)制和信號(hào)傳導(dǎo)等。然APC是Wnt通路的構(gòu)成蛋白之一，同時(shí)APC也是B-鏈蛋白（B-catenin）的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，其可引發(fā)B-catenin在細(xì)胞中堆積，進(jìn)而啟動(dòng)一些新基因的表達(dá)，促使細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和調(diào)控及凋亡等發(fā)生紊亂，最終導(dǎo)致癌變發(fā)生。經(jīng)本次研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，30例正常宮頸上皮組織中未檢測(cè)到腺瘤性結(jié)腸息肉病基因甲基化片段，而宮頸癌組織中，其腺瘤性結(jié)腸息肉病基因甲基化陽(yáng)性率為65.0%（78/120）；兩組陽(yáng)性率比較（P<0.05）；因此而說(shuō)明APC基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的發(fā)生可能具有一定腫瘤特異性。同時(shí)其還可能會(huì)成為診斷宮頸癌的分子標(biāo)記物。宮頸癌組織中，其不同臨床分期間腺瘤性結(jié)腸息肉病基因甲基化陽(yáng)性率比較（P<0.05）；而不同組織學(xué)分級(jí)和是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間腺瘤性結(jié)腸息肉病基因甲基化陽(yáng)性率比較（P>0.05）；說(shuō)明APC基因甲基化在人類宮頸癌發(fā)生中成為一種頻繁且早期發(fā)生的表觀遺傳學(xué)事件。APC基因甲基化可能參與到宮頸癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中。正常宮頸組織沒有發(fā)生甲基化，因此而說(shuō)明如可于癌變前及早實(shí)施相關(guān)及時(shí)而有效的干預(yù)，則可逆轉(zhuǎn)基因甲基化狀態(tài)。伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者預(yù)后較差；本次研究發(fā)現(xiàn)，26例伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌組織，其中14例存在甲基化片段。DNA甲基化可有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，臨床通過(guò)去甲基化制劑等方法來(lái)改變DNA甲基化狀態(tài)，進(jìn)而可有效治療惡性腫瘤患者。本次研究中，不同臨床分期間腺瘤性結(jié)腸息肉病基因甲基化陽(yáng)性率比較（P<0.05），因此而說(shuō)明APC基因甲基化發(fā)生可能參與到宮頸癌進(jìn)展中。臨床III/IV期甲基化率明顯高于臨床早期，臨床上宮頸癌III/IV期治療應(yīng)首選化療治療，但效果并不理想，所以，臨床是否考慮選擇腫瘤生物靶向進(jìn)行治療，以逆轉(zhuǎn)抑癌基因甲基化，進(jìn)而提高臨床晚期癌癥治療效果。

綜上所述，APC基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化是腫瘤發(fā)生過(guò)程中早期事件，因此臨床篩查APC基因甲基化狀態(tài)對(duì)宮頸癌早期診斷具有重要意義，進(jìn)而可有效判斷患者預(yù)后。

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