miRNA-31靶向基質金屬蛋白酶-3基因對宮頸鱗癌侵襲力的影響

肖 黎 張水蓉 胡 萍 陳 燕 張思思

(荊州市中心醫院婦產科，湖北 荊州 434020)

全球每年新增宮頸癌病例約47萬，每年近23萬患者死于宮頸癌〔1〕，嚴重威脅女性健康。微小RNA(miR)是一類長度在20～23個核苷酸編碼的內源性小RNA，廣泛存在于各種生命體。miR參與人類全部細胞周期過程，并調控人類約60%蛋白編碼基因〔2〕，而miR異常表達會導致各種疾病的發生，在腫瘤中miR通過對下游靶基因的調控，發揮癌基因或抑癌基因的功能〔3〕，已在肺癌〔4〕，胃癌〔5〕，乳腺癌〔6〕等多種腫瘤中得到證實。 miR-31被認為是一種抑癌基因，參與多種腫瘤的發生發展，本文觀察上調miR-31后檢測基質金屬蛋白酶(MMP)-3相關指標及侵襲的變化，進一步了解miR-31在宮頸鱗癌細胞系中的生物學功能。

1 材料與方法

1.1材料 組織標本來自于荊州市中心醫院2014年5月至2015年7月，收集新鮮宮頸鱗癌16例，正常宮頸組織16例，均為病理確診，所有標本來源患者無其他腫瘤疾病，未進行過放射或化學治療。siHa細胞系(上海通派生物公司)。

1.2細胞培養及轉染 將解凍復蘇的siHa細胞放置于5%CO2，37℃恒溫箱中培養，并進行傳代，轉染前將細胞接種于6孔板中，設置實驗組、陰性對照組、空白對照組，消化后當細胞密度達60%左右時，取2 μl/孔lipo2000，稀釋于200 μl無血清含各種氨基酸和葡萄糖的培養基(DMEM)，輕混搖勻室溫孵育5 min，與含有4 μl miR-31 mimic的無血清DMEM稀釋液200 μl混合搖勻，室溫靜置15 min；取該混合物加入siHa細胞孔板中，溫箱培養4 h后更換為含血清DMEM，繼續培養48 h后提取總RNA或蛋白。

1.3逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測 收集組織或細胞，勻漿后，Trizol提取液按(1 ml/100 mg組織；1 ml/107個細胞)進行總RNA的提取，并對總RNA進行質量控制。以提取的總RNA，室溫溶解，于冰上配置RT體系25 μl：5×RT緩沖液1 μl，總RNA 2 μl，Poly A聚合酶1 μl，RTase 1 μl，ddH2O 20 μl，搖勻后，37℃孵育45 min，85℃滅活反應酶5 min。PCR體系20 μl：2×成熟體(All-in-oneTM) q-PCR混合物10 μl，All-in-oneTMmiRNA qPCR引物2 μl，50×凹槽氧化參比染料0.4 μl，cDNA (稀釋1∶5～1∶10)2 μl，ddH2O 7.6 μl。95℃ 10 min，預變性；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 10 s，40個循環。以U6RNA作為內參照，按2-△△Ct法計算miR相對表達量。引物序列：miR-31 mimic正向鏈5′-UGCCAAGATGCTGGCATACAU-3′。同法以提取的總RNA逆轉錄，以GAPDH作為內參照，計算MMP-3 mRNA的表達量(引物序列MMP-3：5′-CCTGCTTTGTCCTTTGATGC-3′)。

1.4采用Transwell小室實驗檢測宮頸癌siHa細胞株侵襲性 常規制備Transwell小室，收集消化后的各組細胞，懸浮后，按2.5×104個細胞/孔加入上室，下室加入含血清培養基，放于溫箱培養48 h后，去除上室Matrigel膠和細胞，下室甲醇固定，結晶紫染色，高倍光鏡下進行計數。

1.5Western印跡檢測MMP-3的蛋白表達 收集轉染后48 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2遍，加蛋白提取液，冰上裂解10 min，勻漿后，取上清超聲2次，再10 000 r/min 10 min，再取上清，進行蛋白定量。取等量蛋白(40 μg)于12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，把蛋白轉到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，封閉1 h，分別用GAPDH和MMP-3一抗4℃孵育過夜,二抗孵育1 h后Tween-20 Tris鹽酸緩沖液(TBST)漂洗3次。然后用電化學發光(ECL)試劑暗室顯影。

1.6統計方法 采用SPSS18.0統計軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1兩種組織標本中miRNA-31的表達 與正常宮頸組織(0.659±0.03)對比，宮頸鱗癌組織miR-31(0.045±0.01)明顯下調(P<0.01)。

2.2miR-31在各組宮頸siHa細胞的表達情況 檢測轉染后24 h，實驗組miR-31(0.751±0.04)明顯高于陰性對照組(0.032±0.03)及空白對照組(0.041±0.08)(P<0.01)，表明實驗成功上調miRNA-31表達。

2.3轉染48 h后siHa細胞MMP-3 mRNA的表達情況 實驗組MMP-3 mRNA(0.473±0.188)、陰性對照組(0.492±0.288)及空白對照組(0.388±0.150)差異無統計學意義(F=0.514，P>0.05)。

2.4轉染后48 h MMP-3蛋白表達量 MMP-3蛋白的表達量分別為實驗組(24 837.7±2 930.8)、陰性對照組(18 144.0±3 265.9)、空白對照組(16 111.2±2 416.7)，實驗組MMP-3蛋白的表達量顯著高于陰性對照組及空白對照組(P<0.01)；而陰性對照組與空白對照組間差異無統計學意義(P>0.05)。

2.5上調miR-31對宮頸siHa細胞侵襲性的影響 在轉染后48 h，實驗組平均侵襲數(36.6±3.21)，空白對照組(49.4±3.05)，陰性對照組(46.0±3.65)，實驗組較空白對照組和陰性對照組侵襲數明顯減少(P<0.01)，上調siHa細胞中miR-31的表達，可顯著抑制細胞的侵襲能力。

3 討 論

研究顯示miR可以通過調解下游靶基因表達的方式參與細胞增殖、分化、轉移等生理病理過程〔7〕。Guo等〔8〕通過生物預測發現miR-15b及miR-16同時靶向bcl-2，并通過實驗方法上調肝細胞中miR-15b及miR-16的表達降低bcl-2基因表達，增加含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspases)3、8、9表達，證實了miR-15b/bcl-2/caspases3、8、9及miR-16/bcl-2/caspases3、8、9凋亡調節通路的存在。本研究結果與黃晨等〔9〕研究相符，上調miR-31的相對表達可誘導宮頸癌細胞的凋亡，并抑制癌細胞的淋巴轉移。通過對miR-31進行靶基因預測，MMP-3為其3′-非翻譯區(UTR)潛在靶基因。MMP家族參與組織重塑、血管形成，并是參與細胞外基質(ECM)降解的內肽酶〔10，11〕，最近研究還顯示MMPs在調控腫瘤細胞生長、細胞凋亡、侵襲及免疫監視中發揮重要作用〔11〕。MMP-3能激活其他幾種MMPs，包括MMP-1、MMP-9〔10〕，而研究顯示MMP-1、MMP-7，MMP-9，MMP-13在原發實體腫瘤及轉移瘤中高表達。

研究證實MMP-3在肺癌中的表達與癌細胞轉移情況呈正相關，而且在轉移病灶中MMP-3的表達量顯著升高〔12〕。本實驗提示miR-31與MMP-3基因3′-UTR結合后，導致MMP-3 mRNA翻譯受阻；miR-31可靶向調控MMP-3基因。Zheng等〔13〕證實miR-31作為原癌基因參與宮頸癌的發生及進展，與本文一致。

一種miR可靶向調節多個基因的表達，而同一個靶基因又可接受多個miR的調控，所以有關miR與其靶基因的復雜網絡關系還有待明確，但miR-31有可能成為宮頸癌治療或預后評價的關鍵基因。

4 參考文獻

1Reshmi G，Pillai MR.Beyond HPV：oncomirs as new players in cervical cancer〔J〕.FEBS Lett，2008；582：4113-6.

2Bartel DP.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function〔J〕.Cell，2004；116：281-97.

3Lin S，Gregory RI.MicroRNA biogenesis pathways in cancer〔J〕.Nat Rev Cancer,2015；15：321-33.

4Vescovo VD，Denti MA.microRNA and lung cancer〔J〕.Adv Exp Med Biol,2015；889：153-77.

5Wang Z，Chen W，Zhang Y，etal.Diagnostic value of circulating microRNAs for nasopharyngeal cancer：a systematic review and meta-analysis〔J〕.J Cancer Res Ther，2014；10(Suppl)：C173-8.

6González-Quintana V，Palma-Berré L，Campos-Parra AD，etal.MicroRNAs are involved in cervical cancer development，progression，clinical outcome and improvement treatment response〔J〕.Oncol Rep,2016；35：3-12.

7Zimmerman AL，Wu S.MicroRNAs，cancer and cancer stem cells〔J〕.Cancer Lett,2011；300：10-9.

8Guo CJ，Pan Q，Li DG，etal.miR-15b and miR-16 are implicated in activation ofthe rat hepatic stellate cell：an essential role for apoptosis〔J〕.J Hepatol,2009；50：766-78.

9黃 晨，趙 群，吳玉梅.MiR-31與宮頸癌淋巴專業的相關性研究〔J〕.現代婦產科進展雜志，2013；22(2)：121-5.

10Banik D，Netherby CS，Bogner PN，etal.MMP3-mediated tumor progression is controlled transcriptionally by a novel IRF8-MMP3 interaction〔J〕.Oncotarget，2016；91：131-40.

11Lindsey ML，Iyer RP，Jung M，etal.Matrix metalloproteinases as input and output signals for post-myocardial infarction remodeling〔J〕.J Mol Cell Cardiol,2016;91:131-40.

12Brzóska K，Bartomiejczyk T，Sochanowicz B，etal.Matrix metalloproteinase 3 polymorphisms as a potential marker of enhanced susceptibility to lung cancer in chronic obstructive pulmonary disease subjects〔J〕.Ann Agric Environ Med,2014；21：546-51.

13Zheng W，Liu Z，Zhang W，etal.miR-31 functions as an oncogene in cervical cancer〔J〕.Arch Gynecol Obstet,2015；292：1083-9.