苯酚—硫酸比色法測定瑞麗白芨多糖含量

李國明 張麗萍 戴余波 張玉龍 李守嶺 劉小瓊

摘 要 采用水提醇沉法提取瑞麗白芨粗多糖，以苯酚-硫酸比色法測定白芨多糖含量。結果顯示，最大檢測波長490 nm，6%苯酚溶液用量1.2 mL，濃硫酸用量6.5 mL，反應時間60 min，測定結果較好，吸光度與葡萄糖濃度具有良好的線性關系，線性方程為y=0.009x+0.002 3，相關性系數R2=0.999 5。對白芨多糖樣品進行加標回收率實驗，加標回收率為99.11 % ，相對標準偏差RSD為0.763 3 %，實驗準確度和精密度均較好。

關鍵詞 苯酚-硫酸比色法 ；白芨多糖 ；含量測定

中圖分類號 R284 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.10.014

Abstract The polysaccharide of Bletilla striata grown in Ruili was extracted by water extraction and alcohol precipitation， and determined by the phenol sulfuric acid colorimetry. The results showed that the polysaccharide was better determined when the maximum wave length was 490 nm， the volume of 6% phenol solution 1.2 mL， the volume of concentrated sulfuric acid 6.5 mL， the reaction time 60 mins. There was a good linear relationship between absorbance and glucose content， the linear equation was y=0.009x+0.002 3， and the relative standard deviation （RSD） was 0.763 3%. The determination of polysaccharide with this method was better in accurateness and preciseness.

Keywords phenol sulfuric acid colorimetry； polysaccharide of Bletilla striata ； content determination

白芨，系蘭科植物白芨（Bletilla striata）的干燥塊莖，又稱小白芨、蓮芨草、雪如末等[1]。白芨塊莖主要成分為中性白芨雜多糖，屬吡喃型葡甘聚糖[2]，為多個單糖（α-甘露糖、β-甘露糖和β-葡萄糖等）以糖苷鍵連接而成的聚合物[3]。

白芨多糖具有收斂止血、消腫生肌等功能[4]，對結核桿菌，腫瘤細胞等有明顯的抑制作用[5]，常用于內外出血及癰腫、燙傷、手足皸裂、肛裂等病癥[6]，對抗桿菌，抗真菌，陰虛咳嗽、肺熱咳嗽、百日咳、肺結核咳嗽以及其它難治性咳嗽均有良好止咳作用[7]。同時還可以治療鼻竇炎[8]，外用涂擦，可消除臉上痤瘡痕跡[9]，使肌膚光滑無痕[10]。白芨多糖不僅參與了細胞生命的代謝和調節[11]，而且能增強機體免疫功能[12]，抗腫瘤[13]、抗肝炎[14]、抗潰瘍、調血脂[15]、降血糖、抗衰老[16]等，具有良好的生物可降解性、相容性以及結構可修飾性，在藥物遞送系統、傷口敷料[17]及其他生物材料方面表現出巨大潛力和應用前景。

實驗以葡萄糖為標準品，采用苯酚-硫酸比色法（硫酸將白芨多糖催化水解成單糖，單糖迅速脫水生成糠醛及其衍生物再與苯酚或蒽酮作用生成有色物質[18]，在適當波長和一定濃度范圍內，吸光度值與多糖濃度呈線性關系，從而實現含量測定），對瑞麗市種植的白芨進行多糖提取及含量測定，確定白芨多糖含量的最佳分析測定條件，為進一步開發利用瑞麗市白芨資源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

白芨：購買于瑞麗市臺麗街綜合批發市場（經鑒定為蘭科白芨屬白芨）。將白芨塊莖洗凈，瀝干，切片，放入烘箱60℃烘干、粉碎后，過40目篩，收集，放入干燥器中密封保存，備用。

1.1.2 試劑

葡萄糖標準品，優級純，國藥集團化學試劑有限公司；苯酚，分析純，天津市化學試劑三廠；濃硫酸，分析純，重慶東川化工。

1.1.3 儀器

T6型紫外-可見分光光度儀（北京普析通用儀器有限公司）；UV-8000ST紫外-可見分光光度儀（上海元析儀器有限公司）；電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；中藥材粉碎機（臺灣弘荃機械企業有限公司）；電熱鼓風干燥箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）。

1.2 方法

1.2.1 白芨粗多糖提取

稱取白芨粗粉2.0 kg，用75 %乙醇提取2次，每次2 h，過濾，濾渣干燥。稱取干燥后的濾渣1.0 kg，加入15倍量的水提取2 h，離心過濾后，濾渣再用10倍量的水提取2 h，合并濾液。將濾液濃縮至相對密度為1.15，加入95%乙醇，邊加邊攪拌，直至大量沉淀產生，靜置過夜，濾出沉淀，干燥、粉碎即得白芨粗多糖。

1.2.2 溶液配制

葡萄糖標準溶液配制 精密稱取已恒重的葡萄糖標準品0.100 1 g，溶解后，轉移至100 mL容量瓶中，定容至刻度，充分搖勻，靜置30 min。吸取2.0 mL于50 mL容量瓶中，定容，搖勻后，即得40.04 ug/mL的葡萄糖標準溶液。

待測樣品溶液配制 精密稱取已恒重的白芨粗多糖0.100 0 g，溶解后，轉移至100 mL容量瓶中，定容至刻度，充分搖勻靜置30 min。吸取2.0 mL于50 mL容量瓶中，定容，搖勻后，即得白芨粗多糖待測樣品溶液。

6%苯酚溶液的配制 精密稱取苯酚6.00 g，溶解后，轉移至100 mL棕色容量瓶中，定容，充分搖勻，靜置，避光保存。

1.2.3 最大吸收波長選擇

分別吸取葡萄糖標準溶液0.0、1.0 mL于2支具塞比色管中，使總體積均為1.0 mL，加入6%苯酚溶液 1.2 mL，搖勻后，沿管壁緩慢加入濃硫酸6.5 mL，搖勻，靜置，冷卻。以葡萄糖標準溶液0.0 mL為空白對照，選擇400～600 nm波長范圍，按10.0 nm的精度進行多波長掃描，以吸收波長λ為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制吸光度-吸收波長關系曲線，確定最大吸收波長。

1.2.4 苯酚溶液用量的確定

分別吸取葡萄糖標準溶液各1.0 mL，置于9支具塞比色管中，依次加入6%苯酚溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，加水使各管體積均為3.2 mL，搖勻，各管分別沿管壁緩慢加入濃硫酸6.5 mL，搖勻，靜置30 min。冷水冷卻，于490 nm處測定吸光度。以苯酚用量為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制吸光度-苯酚用量關系曲線，確定苯酚溶液用量。

1.2.5 濃硫酸用量的確定

分別吸取葡萄糖標準溶液各1.0 mL，置于9支具塞比色管中，依次加入6%苯酚溶液1.2 mL，搖勻后沿管壁緩慢加入濃硫酸3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0 mL，加水使各管體積均為9.2 mL，搖勻靜置60 min。冷水冷卻后，于490 nm處測定吸光度。以濃硫酸用量為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制吸光度-濃硫酸用量曲線，確定濃硫酸用量。

1.2.6 穩定性實驗

分別吸取葡萄糖標準溶液1.00 mL，置于9支具塞比色管中，加入6%苯酚溶液1.2 mL，搖勻后沿管壁緩慢加入濃硫酸6.5 mL，搖勻，分別靜置10、20、30、40、50、60、70、80、90 min。冷水冷卻后，于490 nm處測定吸光度。以反應時間t為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制吸光度-反應時間曲線，確定反應的適宜時間及穩定性。

1.2.7 標準曲線的制作

分別吸取葡萄糖標準溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于具塞比色管中，加水使體積均為1.0 mL，加入6%苯酚溶液 1.2 mL，搖勻后沿管壁緩慢加入濃硫酸6.5 mL，搖勻靜置60 min。冷水冷卻后，以葡萄糖標準溶液0.0 mL為空白對照，于490 nm處測定吸光度。以葡萄糖標準溶液濃度為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.8 精密度試驗

分別精確吸取1.0 mL葡萄糖標準溶液于5支具塞比色管中，加入6%苯酚溶液1.2 mL，搖勻后沿管壁緩慢加入濃硫酸6.5 mL，搖勻靜置60 min。冷水冷卻后，以葡萄糖標準溶液0.0 mL份為空白對照，于490 nm處測定吸光度，計算相對標準偏差（RSD%）。

1.2.9 加標回收率試驗

精密稱取白芨樣品5份，每份質量0.100 0 g，依次向白芨樣品中加入0.070 0 g葡萄糖標準品，溶解定容至100 mL容量瓶中，搖勻，靜置。吸取2.0 mL白芨樣品溶液，定容于50 mL容量瓶，搖勻，靜置。吸取0.4 mL于具塞比色管中，加水使體積均為1.0 mL，分別加入6%苯酚溶液 1.2 mL，搖勻后沿管壁緩慢加入濃硫酸6.5 mL，搖勻，靜置60 min，冷水冷卻后，以葡萄糖標準溶液0.0 mL為空白對照，于490 nm處測定吸光度。計算多糖含量及加標回收率。

加標回收率=（加標后多糖測定量-樣品中多糖量）/葡萄糖標準品加入量×100%

1.2.10 白芨粗多糖中多糖含量的測定

精密稱取已恒重的白芨粗多糖6份，每份質量0.100 0 g，配制成白芨粗多糖待測樣品溶液，吸取6份待測樣品溶液各1.0 mL于具塞比色管中，加入6 %苯酚溶液1.2 mL，搖勻后沿管壁緩慢加入濃硫酸6.5 mL，搖勻，靜置60 min。冷水冷卻后，于490 nm處測定吸光度，依據標準曲線計算白芨粗多糖樣品中多糖含量。

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長的選擇

由表1、圖 1可知，最大吸收波長為490 nm。

2.2 苯酚溶液用量的確定

由表2、圖 2可知。苯酚用量在0.2～1.2 mL，吸光度與苯酚用量呈正相關，且具有一定線性關系；當苯酚用量達到1.2 mL時，吸光度出現最大值；之后，隨著苯酚用量的增加，吸光度反而逐漸下降。因此，最佳苯酚用量為1.2 mL。

2.3 濃硫酸用量的確定

由表3、圖 3可知，使用1.2 mL 6%的苯酚溶液，濃硫酸用量在3.0～6.5 mL時，吸光度與濃硫酸用量呈正相關；當濃硫酸用量達到6.5 mL時，吸光度出現最大值；之后，隨著濃硫酸用量的增加，吸光度呈現逐漸下降趨勢。因此，最佳硫酸用量為6.5 mL。

2.4 穩定性實驗

由表4、圖 4可知，在1.2 mL 6%苯酚溶液，6.5 mL濃硫酸條件下，反應時間為10～60 min時，吸光度值呈現逐漸增加趨勢；當反應時間為60 min時，吸光度出現最大值；之后，隨反應時間增加，吸光度呈現逐漸下降趨勢。由此，可以確定加入濃硫酸后的最佳反應時間為60 min，總體來說，反應時間內，吸光度變化較小，呈現比較穩定的變化趨勢。

2.5 葡萄糖標準曲線的制作

通過對吸光度-葡萄糖濃度數據進行線性回歸，得到吸光度值-葡萄糖濃度的線性回歸方程：y=0.009x+0.002 3，線性相關系數R2=0.999 5。由表 5、圖 5可知，吸光度與葡萄糖標準溶液濃度具有良好線性關系。

2.6 精密度實驗

由表 6 可知，精密度實驗的平均吸光度為0.298 4，標準偏差STDEV為0.003 43，相對標準偏差RSD為1.148%。表明該方法精密度較高，滿足實驗要求。

2.7 加標回收率實驗

由表 7可知，5 份平行樣測定的加標回收率為98.24%～100.29%，平均加樣回收率為99.11%，標準偏差STDEV值為0.756 5，相對標準偏差RSD為0.763 3% ，實驗結果滿足加標回收率要求，表明該方法的準確度較好。

2.8 白芨樣品中多糖含量測定

由表8可知，白芨多糖平行樣品測定的多糖含量為65.5%～66.5%，平均多糖含量為66.08%，標準偏差STDEV值為0.376 4，相對標準偏差RSD為0.569 6% ，實驗結果滿足相關要求，方法重現性好。

3 討論

由于苯酚是一種弱酸性的酚類物質，在空氣中久置很容易吸水潮解或部分氧化為苯醌，導致純度、有效濃度下降，進而影響顯色反應，使測定結果有所偏離。因此，苯酚需要密封存放在干燥環境中，且現配現用；濃硫酸在反應中主要是將白芨多糖水解為單糖，并脫水生成糖醛衍生物。實驗過程中，濃硫酸與樣品反應若搖動不充分，使多糖水解為單糖不徹底也會影響多糖含量的測定結果。因此，為保證結果的準確性，加入濃硫酸后應充分搖勻，靜置水解，以減小實驗測定誤差。

本實驗以葡萄糖標準溶液為基準物質，確定了苯酚溶液、濃硫酸溶液的最佳用量及加入濃硫酸后適宜的反應時間。其最佳條件：標準對照物為無水葡萄糖，6%苯酚溶液用量為1.2 mL，濃硫酸用量為6.5mL，濃硫酸反應后適宜的靜置時間為60 min，最合適的吸收波長為490 nm。在此條件下，吸光度與葡萄糖標準溶液濃度呈良好線性關系，線性回歸方程為y=0.009x+0.002 3，線性相關系數R2=0.999 5。加標水平0.070 0 g時，平均加標回收率為99.11%，滿足加標回收率對實驗準確度的要求。由此可見，本實驗分析條件簡單，準確度較高，可靠性較強，顯色反應比較穩定，靈敏度較高，實驗結果重現性較好，可較好地推廣應用于白芨多糖含量的常規檢測。

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