CaN/NFAT3信號通路與心血管疾病研究進展

郭建路 康品方 陶 敏 唐 碧

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管科，安徽 蚌埠 233004)

鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)-T細胞活化核因子(NFAT)3在心血管系統(tǒng)表達豐富,在心血管疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔1〕,關(guān)于CaN/NFAT3信號通路在心肌損傷過程中作用機制的研究愈發(fā)明確。本文對CaN/NFAT3信號通路與心血管疾病研究進展進行綜述。

1 CaN

CaN是普遍存在的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化酶家族中一員，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶全酶是一種異源二聚體，包含與鈣調(diào)蛋白結(jié)合的催化亞基CnA(61 kDa)和與Ca2+結(jié)合的調(diào)節(jié)亞基CnB(19 kDa)。CnA包含N末端的催化區(qū)域，CnB結(jié)合區(qū)域，鈣調(diào)蛋白結(jié)合區(qū)和C末端自身抑制區(qū)域(AID)。在哺乳動物中，CnA由三個基因編碼，分別為CnAα、CnAβ、CnAγ，但只有CnAα(PPP3CA)和CnAβ(PPP3CB)在哺乳動物心臟中表達；CnB分別由CnBα和CnBβ編碼，只有CnBα在心臟中表達〔2〕。CaN參與調(diào)控的信號通路有經(jīng)典的NFATc信號途徑，在CaN的催化下NFATc脫磷酸化進入細胞核內(nèi)，并與轉(zhuǎn)錄因子如GATA4共同參與下調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。然而在細胞核中，CaN則通過抑制輸出蛋白 Crm1與NFATc的結(jié)合〔3〕，使NFATc能夠在核內(nèi)持續(xù)積累而發(fā)揮作用。除了經(jīng)典的NFATc外CaN下游的效應(yīng)分子還有MEF2〔4〕,后者存在于骨骼肌、神經(jīng)及淋巴細胞中。有研究發(fā)現(xiàn)RTA2作為CaN下游的另一個效應(yīng)分子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用〔5〕。

2 NFATc

NFATc家族是Ca2+/CaN依賴的一類轉(zhuǎn)錄因子，包括：NFATc1(NFAT2)、NFATc2(NFAT1)、NFATc3(NFAT4)、NFATc4(NFAT3)和NFAT5〔6〕，除了NFAT5的激活依賴于滲透壓改變之外〔7〕，其他成員是最具特異性的CaN下游活化因子，并且其對于CaN功能的發(fā)揮是必不可少的。CaN調(diào)控NFAT蛋白的保守性區(qū)域包含了兩個串聯(lián)結(jié)合域：①調(diào)節(jié)區(qū)域：也叫NFAT異體同形域(NHR)；②DNA結(jié)合域。其中調(diào)節(jié)區(qū)域在細胞靜止?fàn)顟B(tài)下處于高度磷酸化狀態(tài)，因此NFAT在細胞靜止?fàn)顟B(tài)時被限制在細胞質(zhì)中，不能進入細胞核。NFAT起初是在活化T細胞核中發(fā)現(xiàn)的，是細胞因子表達的重要誘導(dǎo)因子〔8〕。此后，NFAT蛋白已被證明在免疫細胞中扮演不同的角色，包括心血管系統(tǒng)〔9〕，進一步研究發(fā)現(xiàn)NFAT廣泛分布于各組織。NFATc是一種普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，可轉(zhuǎn)錄諸多細胞因子包括白細胞介素(IL)-2、IL-3、IL-4、IL-12，炎癥細胞因子與生長因子〔10〕。進一步研究發(fā)現(xiàn)，分別應(yīng)用CaN 和 NFAT的特異性抑制劑CsA 和A-285222，或應(yīng)用基因干擾技術(shù)使NFAT基因沉默均可有效抑制高糖環(huán)境引起的心血管損傷〔11〕。在心肌纖維化過程中NFAT作為重要的介導(dǎo)信號分子發(fā)揮重要作用〔12〕。

3 Ca2+-CaN-NFATc信號通路的激活

Ca2+/鈣調(diào)素(CaM)-CaN-NFATc 組成鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號通路。在靜止細胞中處于高度磷酸化狀態(tài)的NFAT蛋白存在于胞質(zhì)中，對DNA親和力低；NFATc信號通路的激活與游離Ca2+水平升高密切相關(guān)〔13〕，游離Ca2+水平升高，結(jié)合CaM共同作用于CaN A亞基使之活化，CaN使NFAT脫磷酸化激活，活化的NFAT蛋白能在核內(nèi)保持長時間的活化狀態(tài)。處于脫磷酸化狀態(tài)的NFAT蛋白對DNA親和力增高從而促使靶基因轉(zhuǎn)錄。而鈣離子通道的激活離不開磷脂酶(PL)C-γ，活化的PLC-γ作用于二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2),使PIP2降解為三磷酸肌醇(IP3)和二酰甘油(DAG),IP3進而激活鈣通道，因此NFATc信號通路的激活與PLC-γ密切相關(guān)。

4 Ca2+-CaN-NFATc4信號通路與心肌肥大

心肌肥大是一種受病理性刺激后的代償性反應(yīng)，以此來保持心臟的收縮性和正常的心臟功能。但是，過度心肌肥大可能導(dǎo)致非適應(yīng)性的結(jié)構(gòu)和功能的重構(gòu)，進而引起諸如心律失常，猝死，甚至心力衰竭。心肌肥大是心力衰竭發(fā)展過程中臨床早期的一個標(biāo)志，并且受多種信號通路調(diào)控。在心肌組織中主要表現(xiàn)為細胞表面積和蛋白合成的增加，以及一些胎兒基因的表達，如β-主要組織相溶性復(fù)合體(MHC)、人心鈉素(ANF)、腦鈉肽(BNP)等〔14〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)CaN/NFATc4 信號通路在心肌肥大過程中發(fā)揮重要作用〔15～17〕。CaN/NFATc4信號通路在內(nèi)皮肽-1誘導(dǎo)的心肌肥大過程中起到肥大性信號作用，當(dāng)NFATc4被CaN脫磷酸化后，即會轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)對β-MHC、ANF、BNP肥大基因的表達進行調(diào)控〔14〕。在對重組人小泛素相關(guān)修飾物(SUMO)2的研究中發(fā)現(xiàn)其在心肌肥大中有重要作用，SUMO2能夠增加NFATc的活化程度，誘導(dǎo)肥大相關(guān)基因表達，進而使細胞肥大;并且這種現(xiàn)象在離體和在體實驗兩種情況下都能夠出現(xiàn)，可能機制：SUMO2可以通過非依賴性的類泛素化修飾作用與CaN直接發(fā)生反應(yīng)，進而促進后者轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi);同時內(nèi)源性SUMO2可以活化CaN-NFAT信號通路〔18〕。

Guan等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)CD38 基因敲除的細胞在血管緊張素(Ang)-Ⅱ刺激后，細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和蛋白激酶B(AKT1)的磷酸化水平明顯衰弱。在CD38基因被敲除后，Ca2+信號分子cADPR數(shù)量明顯減少，提示CD38在Ca2+/CaN/NFAT 信號通路中扮演重要角色。另外，當(dāng)把H9C2細胞的CD38基因敲除后，肥大相關(guān)信號AKT的下游效應(yīng)分子GSK-3β的表達受到抑制。一般情況下GSK-3β處于非磷酸化的活化狀態(tài)，而當(dāng)肥大刺激存在時，GSK-3β第九位氨基酸絲氨酸被磷酸化，隨之處于靜止?fàn)顟B(tài)。GSK-3β的上游調(diào)控通路如：磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT、ERK激酶(MEK)/ERK1/2都可以通過磷酸化GSK-3β的絲氨酸磷酸化位點來調(diào)控GSK-3β的活性〔20〕。當(dāng)使用GSK-3β抑制劑1-Azk或使用siRNA干擾時，使用心肌細胞肥大性刺激后心肌細胞表面積有所增加，而當(dāng)GSK-3β激活后，可有效緩解心肌細胞肥大，說明GSK-3β在心肌細胞肥大過程中起到保護性作用。GSK-3β可以通過調(diào)節(jié)NFATc4的N末端保守序列的磷酸化使其從細胞核轉(zhuǎn)出回到胞質(zhì)中。以上說明NFAT信號可以作為刺激信號的下游效應(yīng)分子在心肌肥大性反應(yīng)中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

5 Ca2+-CaN-NFATc4信號通路與心肌纖維化(MF)

MF是多種心臟疾病發(fā)展到一定階段的共同病理改變，是心肌重構(gòu)的主要表現(xiàn)之一，其變化存在于多種心血管疾病中，與心律失常、 心力衰竭等密切相關(guān)。所以預(yù)防和及時改善MF是降低心血管疾病死亡率重要措施。MF是以成纖維細胞產(chǎn)生的細胞外基質(zhì)過量堆積和其本身表型改變分化成纖維母細胞為主要特點的一種病理現(xiàn)象〔21〕。MF是十分復(fù)雜的病理過程，可能有多信號通路介導(dǎo)。羥脯氨酸作為膠原代謝和產(chǎn)生的指示劑已得到廣泛應(yīng)用，目前研究發(fā)現(xiàn)通過抑制CaN途徑可有效消除由去氧腎上腺素誘導(dǎo)的羥脯氨酸堆積和NFAT的核內(nèi)轉(zhuǎn)移〔22〕，提示CaN途徑在細胞外基質(zhì)的調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用；而膠原又是心肌細胞纖維化過程中產(chǎn)生的細胞外基質(zhì)重要成分，這表明CaN途徑在MF過程中有重要意義。Herum等〔23〕對多配體蛋白聚糖-4介導(dǎo)的機械壓力負荷性MF的研究中發(fā)現(xiàn)：當(dāng)心臟成纖維細胞受到機械性壓力負荷時，多配體蛋白聚糖-4會通過激活CaN途徑，增加膠原Ⅰ、膠原Ⅲ mRNA水平，同時平滑肌肌動蛋白(SMA)水平和纖維組織也有所增加〔23〕。因此阻斷多配體蛋白聚糖-4胞內(nèi)段與CaN之間的相互作用進而抑制其下游效應(yīng)分子NFAT誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，可能有效減弱壓力負荷性MF水平。鈣信號對激活一些鈣敏感性酶如蛋白激酶C、鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱ和CaN是必不可少的。磷脂酶C活化可催化PIP2產(chǎn)生IP3和DAG。IP3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的受體結(jié)合，釋放鈣離子。活化的CaN使NFAT活化進入細胞核內(nèi)激活其應(yīng)答基因〔24〕。

腺苷是普遍存在的嘌呤核苷，它的存在對細胞功能的調(diào)控有重要作用。在心血管系統(tǒng)中腺苷呈現(xiàn)出豐富功能：冠狀動脈擴張、心率控制、房室節(jié)律、心肌肥大和MF等方面。腺苷通過與其位于胞膜外受體(AR1、AR2A、AR2B、AR3)結(jié)合，AR胞內(nèi)段再與G蛋白耦聯(lián)作用激活下游一系列級聯(lián)反應(yīng);腺苷酸環(huán)化酶(AC)和PLC被激活，分別活化下游環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和PIP2。激活不同腺苷受體在MF方面有不同作用〔25〕。AR2A受體活化有抗纖維化作用〔26〕，PI3K激活并進入細胞核抑制促纖維化基因表達，降低膠原產(chǎn)生;而另外三種腺苷受體則可能表現(xiàn)為促MF作用，其中AR1、AR3通過抑制腺苷酸環(huán)化酶進而抑制PI3K，AR2B則通過使PIP2活化產(chǎn)生IP3和DAG，進一步使鈣通道活化釋放鈣離子。鈣離子釋放使鈣依賴性酶CaN激活，進而使CaN/NFATc信號通路活化。由此可見，活化的腺苷受體可能通過CaN途徑激活促纖維化基因的表達,但具體機制需進一步研究證明。

6 Ca2+-CaN-NFATc信號通路與冠心病

冠心病是動脈粥樣硬化導(dǎo)致器官病變最常見類型，也是嚴(yán)重危害人類健康的常見病。報道表明CaN/NFATc信號通路在冠狀動脈平滑肌細胞和血管壁形成中有重要作用〔27〕，通過染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(ChIP)檢測出NFATc4可以促進Smad2 轉(zhuǎn)錄，后者作為轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β下游信號的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，當(dāng)TGF-β與其受體結(jié)合后招募smad蛋白并使其進入細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄平滑肌增殖分化基因，促進冠狀動脈管壁形成。內(nèi)皮損傷反應(yīng)學(xué)說認為冠狀動脈粥樣硬化各種主要危險因素最終都損傷動脈內(nèi)膜，而粥樣硬化病變的形成是動脈對內(nèi)皮、內(nèi)膜損傷做出的炎癥-纖維增生性反應(yīng)的結(jié)果。目前認為氧化低密度脂蛋白(oxLDL)是最重要的致粥樣硬化因子，是損傷內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的主要因子。在Bear等〔28〕研究中發(fā)現(xiàn)oxLDL能夠協(xié)同β-磷酸甘油共同促進原代培養(yǎng)的動脈平滑肌細胞表達成骨細胞分化轉(zhuǎn)錄因子Osx并向成骨細胞分化，并提出在機體內(nèi)oxLDL可以促進成骨細胞分化和血管鈣化。有研究顯示NFAT信號在介導(dǎo)oxLDL損傷血管平滑肌過程中起重要作用〔29〕，NFAT信號可以介導(dǎo)經(jīng)oxLDL誘導(dǎo)的血管平滑肌鈣化和向骨母樣細胞轉(zhuǎn)化，而二者均為動脈粥樣硬化過程中重要的一部分,然而研究只涉及NFATc1和NFATc2兩種因子，至于NFATc4(NFAT3)是否存在類似的作用尚無明確證據(jù)報道，但是NFAT3在心血管系統(tǒng)中有豐富表達，不難預(yù)測NFAT3在介導(dǎo)oxLDL誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化過程中發(fā)揮作用，但仍需進一步實驗研究證明。

綜上，CaN/NFAT3信號通路在心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，其可參與調(diào)控心肌肥大、MF等過程，在冠心病進程中也有調(diào)控作用；雖然NFAT3信號在心血管系統(tǒng)中作用得到肯定，但是其具體機制還有待進一步闡明，這對于針對其特異性藥物的應(yīng)用意義重大。鈣信號特異性阻斷藥物在臨床應(yīng)用常見，但這勢必會產(chǎn)生一些副作用，NFAT3信號作為鈣信號的下游重要成分發(fā)揮作用，針對其特異性阻斷藥物在臨床應(yīng)用少見報道，未來應(yīng)著眼于明確NFAT3信號在心血管系統(tǒng)中作用機制研究，并進一步探索其可能存在的下游分子，進而研制出更為精確的靶向藥物。