AKT/HIF/VEGF信號通路與p—NMDAR2B在難治性癲癇相關性FCD致癇灶中的作用及相關因素分析

張揚+方富+林元相

[摘要] 目的 研究AKT/HIF/VEGF信號通路與p-NMDAR2B在難治性癲癇相關性FCD致癇灶中的作用及相關因素分析，探討兩者在FCD致癇灶中的作用及相關因素分析。方法 該研究于2010年1月—2015年1月間方便選取在福建醫科大學附屬第一醫院神經外科進行手術治療的50例難治性癲癇患者，所有患者均經術后病理證實為FCD，將術后病灶腦組織進行研究分析，作為實驗組；其中FCDⅠ型30例，FCDⅡ型20例。同時另外選取50例行減壓或清創手術的腦外傷患者，將術中獲取的和各種病變患者手術入路不可避免要切除的正常腦組織進行研究，納入對照組。均利用免疫組織化學染色和Western blot方法檢測上述腦組織中的p-AKT1/2/3（Thr308）、HIF-1、VEGF以及p-NMDAR2B（Tyr1336）的表達情況和蛋白水平。觀察各型癲癇患者和正常腦組織p-AKT1/2/3（Thr308）、HIF-1、VEGF以及p-NMDAR2B（Tyr1336）的表達情況、免疫組化積分情況以及β-actin灰度比值情況。 結果 ①各型難治性癲癇相關性FCD致癇灶中AKT/HIF/VEGF信號通路發生不同程度激活表現，屬異常現象。②Western blot：p-AKT1/2/3（Thr308）、HIF-1、VEGF以及p-NMDAR2B（Tyr1336）在FCDⅠ型病灶中表達水平分別為（0.619 3±0.078 4）、（0.779 2±0.039 1）、（0.752 8±0.099 4）以及（0.641 4±0.091 9）；在FCDⅡ型病灶中表達水平分別為（0.885 9±0.031 1）、（0.862 9±0.035 5）、（0.839 2±0.038 1）以及（0.908 8±0.037 3），均明顯高于正常腦組織的（0.404 2±0.084 9）、（0.467 9±0.013 8）、（0.479 8±0.045 1）以及（0.349 2±0.090 7），差異有統計學意義（P<0.05）。 結論 AKT/HIF/VEGF信號通路可能是通過調控NMDA受體活性參與了FCD相關難治性癲癇的發生發展。

[關鍵詞] 局灶性皮質發育不良；難治性癲癇；機制；AKT/HIF/VEGF信號通路；NMDA受體

[中圖分類號] R737 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）10（c）-0015-04

The Significance and Relativity Analysis of AKT/HIF/VEGF Signal Path and p-NMDAR2B in the Epileptogenic Zone of the Focal Cortical Dysplasias Relative Intractable Epilepsy

ZHANG Yang1， FANG Fu2， LIN Yuan-xiang2

1.Neurosurgical Department， Fujian Provincial Hospital， Fuzhou， Fujian Province， 350001 China； 2.Neurosurgical Department， the First Hospital Affiliated to the Fujian Medical University， Fuzhou， Fujian Province， 350005 China

[Abstract] Objective This paper tries to investigate the role and correlation of AKT / HIF / VEGF signaling pathway and p-NMDAR2B in refractory epilepsy-related FCD-induced epileptic foci， and to explore the role and correlation of AKT / HIF / VEGF signaling pathway in FCD-induced epileptic foci. Methods In this study， 50 patients with refractory epilepsy who underwent surgical treatment at the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University from January 2010 to January 2015. All patients were convenient confirmed to be FCD by postoperative pathology. The postoperative brain tissue was performed and analyzed， as the experimental group； of which 30 cases of FCD Ⅰ， 20 cases of FCD Ⅱ type. At the same time， 50 patients with brain injury undergoing decompression or debridement were selected. The normal brain tissue was removed from the control group. The p-AKT1/2/3 （Thr308）， HIF-1， VEGF and p-NMDAR2B （Tyr1336） in the brain tissue were detected by immunohistochemical staining and Western blot. The expressions of p-AKT1/2/3 （Thr308）， HIF-1， VEGF and p-NMDAR2B （Tyr1336） in the epilepsy and normal brain tissues were observed. The expressions of immunohistochemistry and β-actin gray ratio were observed. Results ①Various types of refractory epilepsy-related FCD-induced epilepsy in the AKT / HIF / VEGF signaling pathway to varying degrees of activation performance were abnormal phenomena. ②Western blot： The expression levels of PIF-AKTb 1/2/3 （Thr308）， HIF-1α， VEGF and p-NMDAR2B（Tyr1336） in FCD Ⅰ lesions were （0.619 3±0.078 4）， （0.779 2±0.039 1）， （0.752 8±0.099 4）， （0.641 4±0.091 9） respectively， and those in FCDⅡwere （0.885 9±0.031 1）， （0.862 9±0.035 5）， （0.8392±0.0381） and （0.908 8±0.037 3）， which were significantly higher than those in the control group of （0.404 2±0.084 9）， （0.467 9±0.013 8）， （0.479 8±0.045 1） and （0.349 2±0.090 7）， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion The AKT / HIF / VEGF signaling pathway may be involved in the development of FCD-associated refractory epilepsy by regulating NMDA receptor activity.endprint

[Key words] Focal cortical dysplasia； Refractory epilepsy； Mechanism； AKT/HIF/VEGF signaling pathway； NMDA receptor

癲癇是臨床兒科最常見疾病之一，雖然近年來抗癲癇藥物不斷出現，但仍然有部分患兒進展為難治性癲癇，給患兒帶來極大危害。隨著對難治性癲癇的不斷深入研究，顯示難治性癲癇與AKT/HIF/VEGF以及p-NMDAR2B等信號通路有密切關系。因此該文對福建醫科大學附屬第一醫院神經外科2010年1月—2015年1月期間收治的50例難治性癲癇患者作為研究對象，探討AKT/HIF/VEGF信號通路與p-NMDAR2B在難治性癲癇相關性FCD致癇灶中的作用及相關性分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該研究方便選取在福建醫科大學附屬第一醫院神經外科進行手術治療的50例難治性癲癇患者，所有患者均經術后病理證實為FCD，將術后病灶腦組織蠟塊進行研究分析，根據2011年國際抗癲癇聯盟專家共識標準重新分類[1]，該次研究中實驗組所有蠟塊均行HE染色后分類評估，結果表明符合診斷為FCDⅠ型30例，FCDⅡ型20例。排除標準：不典型病變、存在FCD診斷爭議、血管畸形、腦軟化灶、良性腫瘤、海馬硬化等FCDⅢ型。

同時另外選取50例行減壓或清創手術的腦外傷患者，將術中獲取的和各種病變患者手術入路不可避免要切除的正常腦組織進行研究，納入對照組。這些患者之前無驚厥史和其他神經病史，納入標準：該次研究已取得患者及家屬知情同意；取得福建醫科大學生物醫學研究倫理委員會批準，符合各項準則。

1.2 標本分組及石蠟切片制作

分實驗組1（FCDⅠ型30例）、實驗組2（FCDⅡ型20例）以及對照組（正常腦組織8例）。

1.2.1 取材、固定、標本切片 取得標本后，分成2個部分，一部分立即浸泡于10%福爾馬林溶液中固定，固定時間>24 h，予石蠟包埋，逐步進行腦組織脫水透明浸蠟，切片備用。另一部分組織取出后放液氮保存1 h后移到-80℃冰箱保存，做好標記予Western blot備用。

1.2.2 結果判定 在神經元及膠質細胞中，觀察p-AKT1/2/3（Thr308）、HIF-1、VEGF以及p-NMDAR2B（Tyr1336）表達結果顯示免疫組化染色陽性結果為棕黃色或棕褐色顆粒[1]。

1.3 Western blot

經過以下步驟：采用組織裂解方法進行蛋白樣本提取制備，采用BCA法蛋白定量，及 SDS-PAGE蛋白質電泳、轉膜、封閉及雜交、曝光等步驟，最后進行結果判定。

1.4 統計方法

免疫組化得分和Western blot灰度值相關數據以均數±標準差（x±s）表示，使用GraphPad Prism統計學軟件進行數據分析；采用SPSS統計學軟件，根據數據特征獨立樣本t檢驗，結合方差齊性分析得出統計結果，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

各指標在FCDⅠ型、Ⅱ型及正常腦組織中總體半定量分析、免疫組化積分得分情況表1、表2；各指標在FCDⅠ型和Ⅱ型免疫組化得分情況見表3；各組指標與 -actin灰度比值分析件表4；各指標在FCDⅠ型和Ⅱ型 -actin灰度比值分析見表5。

3 討論

國內外對于FCD致癇機制的研究仍不十分明確，目前普遍認為是由于興奮性與抑制性神經遞質系統紊亂，亦可其受體損害所致[1-3]。

AKT/HIF/VEGF是一條經典的血管機制信號通路[4]，已有研究發現此信號通路不僅僅作用于血管內皮細胞，在中樞神經系統中，還可以直接作用于神經元和膠質細胞。PI3K是一種可使肌醇環上第3位羥基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶，PI3K活化后，其可使細胞膜上的肌醇磷酸化，磷酸化過程中產生的第二信使結合AKT及下游信號通路；AKT在Thr308磷酸化后被活化為p-AKT，直接或間接調節多種轉錄因子的表達及影響凋亡蛋白活性的表達[5-6]。

該實驗針對難治性癲癇相關性FCD致癇灶中p-AKT1/2/3（Thr308）、HIF-1、VEGF以及p-NMDAR2B（Tyr1336）的表達情況和蛋白水平，檢測FCD致癇灶中是否存在上述各指標的差異表達，AKT/HIF/VEGF信號通路是否異常激活，VEGF與p-NMDAR2B在FCD相關性難治性癲癇的發生發展中是否存在一定的因果關系。我們實驗結果顯示，p-AKT1/2/3（Thr308）、HIF-1、VEGF以及p-NMDAR2B（Tyr1336）在FCDⅠ型病灶中表達水平分別為（0.619 3±0.078 4）、（0.779 2±0.039 1）、（0.752 8±0.099 4）以及（0.641 4±0.091 9）；在FCDⅡ型病灶中表達水平分別為（0.885 9±0.031 1）、（0.862 9±0.035 5）、（0.839 2±0.038 1）以及（0.908 8±0.037 3），均明顯高于正常腦組織的（0.404 2±0.084 9）、（0.467 9±0.013 8）、（0.479 8±0.045 1）以及（0.349 2±0.090 7），差異有統計學意義（P<0.05），也進一步證實了目前的研究觀點。

在中樞神經系統，p-AKT對神經元和膠質細胞均起到一定的影響作用，主要表現在細胞的增值，分化遷徙以及細胞的存活；在FCD相關的難治性癲癇發作期間，存在有皮層神經元缺血缺氧，這種病灶微環境能夠通過激活PI3K/AKT信號通路，誘導AKT磷酸化，進而促進HIF-1蛋白表達；而HIF-1在胞漿中表達增高趨勢，逐漸轉移至核內；進而推測在FCD中存在有p-AKT介導HIF/VEGF信號通路的激活。然而誘導VEGF表達的分子機制可能是HIF-1[7]，在缺氧環境下，作為一種核轉錄因子，能夠上調VEGF的轉錄翻譯；尤其是在癲癇長時間發作比如癲癇持續狀態，缺氧對于誘導VEGF表達是一個重要的扳機點[8]。其他的轉錄因子如AP-1、NF-κB以及炎癥因子IL-1β證明也存在有上調VEGF表達的作用。endprint

該研究發現在FCD中AKT/HIF/VEGF信號通路異常激活，且誘導表達的VEGF和p-NMDAR2B上調與FCD相關性難治性癲癇有關，若以兩者為切入點，可能為癲癇的臨床治療提供更為廣闊的應用前景，為抗癲癇尋求新的治療靶點，對抗癲癇新藥的研制提供新的思路。

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（收稿日期：2017-07-22）endprint