HBx與microRNA—21在肝細胞肝癌中的相互作用及其機制研究

何曉

【摘要】 目的：探討乙型肝炎病毒（HBV）基因編碼的X蛋白（HBx）與microRNA21（miR-21）在肝細胞癌HepG2細胞中的作用。方法：選取人肝癌細胞株HepG2細胞，隨機分為HepG2細胞組、GFP腺病毒組和HBx腺病毒組，其中GFP腺病毒組和HBx腺病毒組細胞分別感染GFP腺病毒和HBx腺病毒，采用流式細胞儀檢測各組細胞周期，Transwell檢測細胞侵襲能力，Western blot檢測ER蛋白表達，RT-PCR檢測HBx mRNA和miR-21表達。結果：HBx腺病毒組HBx mRNA相對表達量為（0.805±0.030），明顯高于HepG2細胞組和GFP腺病毒組（P<0.05）；HBx腺病毒組細胞G1期比例為（34.24±2.10）%，明顯低于HepG2細胞組和GFP腺病毒組（P<0.05），而S期細胞比例為（56.80±2.09）%，明顯高于HepG2細胞組和GFP腺病毒組（P<0.05）；HBx腺病毒組miR-21表達為（1.892±0.038），明顯高于HepG2細胞組和GFP腺病毒組（P<0.05），而ERα蛋白表達為（0.21±0.03），明顯低于HepG2細胞組和GFP腺病毒組（P<0.05）；HBx腺病毒組穿膜細胞數為（78.12±8.78），明顯高于HepG2細胞組和GFP腺病毒組（P<0.05）。結論：HBx可促進肝癌細胞增殖及侵襲能力，其機制可能與上調miR-21表達和下調ER表達有關。

【關鍵詞】 HBx蛋白； miR-21； 肝細胞癌； 增殖； 侵襲能力

【Abstract】 Objective：To investigate the role of hepatitis B virus（HBV） gene encoded X protein（HBx） and microRNA21（miR-21） in hepatocellular carcinoma HepG2 cells.Method：Human hepatoma cell line HepG2 was selected and randomly divided into HepG2 cell group，GFP adenovirus group and HBx adenovirus group，GFP adenovirus group and HBx adenovirus group were infected with GFP adenovirus and adenovirus HBx respectively，flow cytometry was used to detect the cell cycle，Transwell was used to detect invasion ability of cells，Western blot was used to detect the expression of ER protein，RT-PCR was used to detect HBx and miR-21 mRNA expression.Result：The relative expression of HBx and mRNA in HBx adenovirus group was （0.805±0.030），significantly higher than those in HepG2 cell group and GFP adenovirus group（P<0.05）；HBx adenovirus group the proportion of cells in G1 phase was（34.24±2.10）%，significantly lower than those in HepG2 cell group and GFP adenovirus group（P<0.05），while the proportion of S stage was（56.80±2.09）%，significantly higher than those in HepG2 cell group and GFP adenovirus group（P<0.05）；HBx adenovirus group miR-21 expression was （1.892±0.038），significantly higher than those in HepG2 cell group and GFP adenovirus group（P<0.05），while ERα protein expression was （0.21±0.03），was significantly lower than those in HepG2 cell group and GFP adenovirus group（P<0.05）；the number of transmembrane cells in HBx adenovirus group was （78.12±8.78），significantly higher than those in HepG2 cell group and GFP adenovirus group（P<0.05）.Conclusion：HBx can promote hepatocellular carcinoma cell proliferation and invasion， the expression of the mechanism may be related to the upregulation of miR-21 and downregulation of ER expression.

【Key words】 HBx protein； miR-21； Hepatocellular carcinoma； Proliferation； Invasivenessendprint

First-authors address：The First Affiliated Hospital of Gannan Medical College，Ganzhou 341000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.36.003

肝細胞肝癌是全球第六大常見的癌癥，其致死率高居第三位[1]。乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）是一種17k Da的可溶性蛋白，同時存在于肝癌細胞的胞核和胞質內，是HBV相關肝癌形成的重要因素[2]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種廣泛存在于真核生物中的非編碼內源性的單鏈小分子RNA[3]。miRNA具有高度保守性、時序性和組織特異性的特點，通過與靶基因3非編碼區結合，引起靶基因mRNA的降解或抑制靶基因mRNA的翻譯，對生物體轉錄后的基因表達調控起關鍵作用。文獻[4]研究表明，miR-21在肝細胞癌、非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤中異常表達，參與調控細胞增殖、凋亡、細胞周期分布等多個生物學過程。本研究擬通過將乙型肝炎病毒基因編碼的X蛋白（HBx）感染肝癌細胞HepG2，以Real-time PCR檢測miR-21表達變化，明確其在肝細胞癌HepG2細胞中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 人肝癌細胞株HepG2購買自中國科學院細胞庫，細胞培養于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基中，培養條件為37 ℃，5%CO2濃度，飽和濕度。

1.2 實驗方法

1.2.1 腺病毒感染HepG2細胞 將指數期的HepG2細胞隨機分為三組即HepG2細胞組、GFP腺病毒組和HBx腺病毒組。其中HepG2細胞組不做任何處理；以感染復數值200分別加入Ad/CMV-GFP及Ad/hTERT-GFP-Hbx轉染HepG2細胞，分別為GFP腺病毒組及HBx腺病毒組，轉染后24、48、72 h收集細胞，進行后續檢測。

1.2.2 Transwell檢測細胞侵襲能力 將待測細胞制成細胞懸液，在每個Transwell小室中緩慢加入已配置好的細胞懸液100 ?L，下室小心加入10%FBS的培養基500 ?L，去除氣泡，放入37 ℃，5%CO2培養箱，常規培養48 h。常規培養48 h后，棄去培養液，用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞，甲醇固定15 min，以PBS清洗，0.1%結晶紫染色5～10 min，置于倒置顯微鏡下觀察，拍攝和細胞計數。

1.2.3 流式細胞儀檢測 收集待測的三組細胞各2×105個（包括上清），1 mL PBS室溫下重懸。加入-20 ℃預冷的70%乙醇4 mL，混勻后-20 ℃靜置過夜。1500 r/min，離心5 min，棄乙醇，5 mL PBS室溫下重懸，水化15 min。1500 r/min，離心5 min，棄上清，避光條件下加入1 mL DNA標記液，室溫下孵育30 min。1 h內以流式細胞儀檢測細胞周期分布情況。

1.2.4 Western blot檢測 提取待測細胞的總蛋白，以BCA試劑盒測定各組蛋白濃度。將各組蛋白與Loading buffer充分混合后100 ℃煮沸5 min，每孔50 μL加入到SDS-PAGE凝膠上樣孔中進行電泳和轉膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉。加入稀釋后的待測一抗4 ℃過夜。TBST清洗后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG（1∶1000稀釋）。37 ℃孵育1 h，TBST清洗后以ECL發光液顯影，自動凝膠成像系統采集圖像，以GAPDH為內參。

1.2.5 RT-PCR檢測 用Trizol法提取待測細胞的總RNA。反應條件為95 ℃ 30 s，（95℃

5 s，60℃ 34 s）×40循環，以ABI 7500實時定量PCR系統進行實驗，收集熒光信號，并建立PCR產物的熔解曲線，重復三次實驗，以2-average△△CT法分析比較。HBx引物序列：上游5-TGTGAAGCTTATGGCTGCTAGGC-3，下游5-TGTGGAATTCTTAGGCAGAGGTG-3；miR-21引物

序列：上游5-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3，下游5-GAATTTGCGTGTCATCCTTGCG-3；內參U6引物序列：5-GCTTCGGCAGCACATCTCATAAAAT-3，5-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3。

1.3 統計學處理 統計分析采用SPSS 19.0軟件，計量資料采用（x±s）表示，組間比較使用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組HBx mRNA表達比較 HBx腺病毒組HBx mRNA相對表達量為（0.805±0.030），明顯高于HepG2細胞組的（0.201±0.024）和GFP腺病毒組的（0.198±0.013），差異均有統計學意義（P<0.05）；HepG2細胞組和GFP腺病毒組HBx mRNA相對表達量比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

2.2 各組HepG2細胞周期比例比較 各組HepG2細胞G2期細胞比例比較，差異無統計學意義（P>0.05）；HBx腺病毒組細胞G1期比例明顯低于HepG2細胞組和GFP腺病毒組（P<0.05），而S期細胞比例明顯高于HepG2細胞組和GFP腺病毒組（P<0.05）；HepG2細胞組和GFP腺病毒組細胞周期比例比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.3 各組細胞侵襲能力比較 HBx腺病毒組穿膜細胞數為（78.12±8.78），明顯高于HepG2細胞組的（53.11±8.90）和GFP腺病毒組的（55.02±9.21），差異均有統計學意義（P<0.05）；HepG2細胞組和GFP腺病毒組穿膜細胞數比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖2。endprint

2.4 各組HepG2細胞miR-21和ER蛋白表達 HBx腺病毒組miR-21相對表達量為（1.892±0.038），明顯高于HepG2細胞組的（0.981±0.034）和GFP腺病毒組的（0.948±0.041），差異均有統計學意義（P<0.05）。HBx腺病毒組雌激素受體α（ERα）蛋白表達明顯低于HepG2細胞組和GFP腺病毒組，差異均有統計學意義（P<0.05）。HepG2細胞組和GFP腺病毒組miR-21相對表達和ERα蛋白表達比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖3。

3 討論

腫瘤干細胞（CSC）被認為是許多血液系統惡性腫瘤及實體腫瘤的來源[5]。目前已經逐漸認識到一部分的肝細胞肝癌（HCC）可能來源于發生了惡性轉化的肝臟前體細胞。HBx起源的腫瘤被認為具有肝前體細胞表型，并且表現出更強的侵襲性[6]。3，5-二乙酯基-1，4-二氫可力丁（DDC）誘導可在肝臟內通過HBx促進人肝臟祖細胞的擴增和惡性轉化，且在長期DDC作用下，HBx轉基因肝臟可誘導形成混合型肝癌。這些結果不僅為肝前體細胞參與肝癌的形成提供了新的證據，也說明了HCC的發生發展可能與HBx過表達有關[7]。

在本研究中發現，HBx過表達可提高HepG2細胞S期細胞比例，降低G1期細胞比例，并且提高HepG2細胞的侵襲能力，說明HBx表達增加可促進肝癌細胞轉移，這可能是因為HBx過表達使得肝前體細胞表型增加有關。HBx過表達可促使細胞內源性胞內信號通路改變，最終導致肝癌細胞惡性程度增加[8]。

隨著對miRNA-21作用機制和功能研究的深入，miR-21與腫瘤的關系受到了越來越多的重視[9-11]。HCC是最常見的消化系統腫瘤之一，在世界范圍內均具有較高的發病率和死亡率[12-14]。在大量的HCC病例的研究中，研究者們認識到HCC的發生發展過程中涉及到一系列HBx基因的改變等問題，但是HBx基因的表達受何種機制調控還不明確。隨著對miR-21的研究深入，發現miR-21的表達水平可能受到HBx調控，在HCC發生發展過程中發揮著重要的作用[15]。大量的基礎研究證實miR-21可以直接促進細胞增殖、抑制細胞凋亡或促進細胞轉移[16]。在HCC細胞中，miR-21還可靶向抑制Rb-E2信號傳導通路，阻斷G1/S期演進[17]。

本研究發現，HBx過表達時，miR-21表達增加，肝癌細胞G1期細胞比例降低，S期細胞比例增加，與文獻[15-16]研究報道相一致。HBx過表達對肝癌細胞的促增殖和促轉移作用可能是借由對miR-21的調控作用實現的。另外，雌激素受體α（ERα）在HBx過表達時蛋白水平明顯降低，在臨床組織標本的研究中發現，ERα低表達意味著腫瘤直徑增加，更多的血管侵犯和更高的腫瘤惡性程度[18-20]，HBx可能借由調控ERα表達影響肝癌細胞的惡性程度[21]。但是，HBx對ERα的具體調控機制及其與miR-21的關系還需生物信息學分析及熒光素酶報告實驗進一步探究。

本研究借由腺病毒轉染構建了過表達HBx的HepG2細胞系，發現HBx過表達可增加S期細胞比例，降低G1期細胞比例，增加肝癌細胞侵襲能力，這種對細胞周期和細胞侵襲的調控作用可能是藉由miR-21表達升高和ERα蛋白水平降低實現的，在后續的研究中，還需進一步探究HBx與miR-21及ERα的調控關系和機制，并完善動物實驗和臨床組織標本研究證據。

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（收稿日期：2017-10-25） （本文編輯：張爽）endprint