利用紫蘇粕和豆粕發酵生產紫蘇醬的制曲工藝研究

張昕，徐連爽，王雪瑩，許宏源

(1.吉林工商學院 糧油食品深加工吉林省高校重點實驗室，長春 130507;2.吉林工商學院 糧食學院，長春 130507)

紫蘇Perillafrutescens(L.)Britt是傳統的藥食同源植物，富含α-亞麻酸、花青素、甾醇、紫蘇酮、紫蘇醛和丁香油酚等特殊的營養和活性成分[1]。其果實紫蘇籽冷榨紫蘇油剩余的紫蘇粕中，含有高達40%左右的蛋白質[2]，內含18種氨基酸，含有人體所必需的8種氨基酸，其中賴氨酸、蛋氨酸的含量較高[3]。此外紫蘇粕中還含有粗纖維17.3%、粗脂肪8.7%和紫蘇特殊的活性成分，具有很高的營養價值[4]。目前，大量的紫蘇粕經簡單加工添加到飼料中，紫蘇粕資源未得到充分利用[5]。我們研究利用紫蘇粕和豆粕共發酵生產紫蘇醬，有效利用紫蘇粕的營養價值和保健價值，紫蘇粕特殊的營養成分、活性成分和風味物質保留在醬中，比傳統豆醬的調味、增香和保健功能更勝一籌。本研究探索發酵生產風味紫蘇醬產品的制曲工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

L-酪氨酸 上海荔達生物科技有限公司；Folin-酚試劑 上海分子免疫生化實驗室有限公司；干酪素、其他試劑(分析純) 上海國藥集團化學試劑有限公司；紫蘇粕、豆粕、面粉(標準粉) 產地吉林省洮南市；食鹽 市售。

1.1.2 菌種

高大毛霉F3.06(Mucormucedo)：吉林工商學院微生物實驗室從自然發酵的紫蘇粕中分離的菌種。

1.1.3 培養基

制曲培養基：紫蘇粕35 g、豆粕65 g、面粉18 g、料水比10∶8。pH自然，121 ℃滅菌25 min[6，7]。

1.2 儀器與設備

DHG-9023A臺式電熱恒溫鼓風干燥箱 北京神泰偉業儀器設備有限公司；LDZX-40BI立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；SPX-250B-Z型生化培養箱 上海博迅實驗有限公司醫療設備廠；SPH-2102C溫度培養振蕩器 上海世平實驗設備有限公司；755B紫外可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；DFY-1000C實驗室萬能粉碎機 上海豫明儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 成曲制備工藝流程

1.3.1.1 孢子懸液制備

采用培養120 h的高大毛霉斜面菌種。用含有0.1%吐溫80的無菌水10 mL洗脫孢子，移入三角瓶中，加入蝸牛酶和已滅菌的玻璃珠振蕩20 min左右，過濾除去菌絲和成團的孢子。用血球計數板測定孢子濃度并用無菌生理鹽水稀釋孢子濃度約為1×106cfu/mL[8]。

1.3.1.2 制曲方法

紫蘇粕、豆粕粉碎為2.8 mm顆粒，料水比10∶8，添加40 ℃溫水浸潤8 h后，加入面粉混勻，121 ℃滅菌25 min，料溫自然降到32 ℃時，接種1×106cfu/mL高大毛霉F3.06孢子懸液，混合均勻后裝入曲盤培養，控制曲室溫度，按照實驗設計時間定時翻曲1 min，曲料由白色轉為灰褐色時，制得成曲[9]。

1.3.2 中性蛋白酶活力測定方法

中性蛋白酶活力測定采用Folin-酚試劑比色法。

1.3.2.1 標準曲線的繪制

取18支試管分成6組，每組3個平行樣，其中第1組的3支試管不加標準酪氨酸溶液做空白對照，其余5組試管中分別吸取100 μg/mL標準酪氨酸溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL；6組試管中分別加入去離子水定容至1 mL，各加入0.4 mol/L的Na2CO3溶液5 mL和已稀釋的Folin-酚試劑1 mL，搖勻，置40 ℃水浴鍋中保溫發色20 min，用分光光度計在660 nm處測定吸光度值[10,11]。

1.3.2.2 成曲粗酶液的制備

稱取成曲1.00 g放入研缽中，逐漸加入pH 7.0的磷酸緩沖液50 mL研碎，置于40 ℃恒溫振蕩器中，以100 r/min浸提30 min，4層紗布過濾，濾液在4 ℃,4000 r/min離心15 min去除固形物，上清液用pH 7.0的磷酸緩沖液定容到100 mL即為粗酶液[12]。

1.3.2.3 成曲酶活力的測定

取4支試管，1號為空白，其余3支為樣品，分別加入成曲粗酶液1 mL，1號管立即加入0.4 mol/L的TCA溶液2 mL使酶失活，另3支樣品試管分別加入pH 7.0濃度為2%的酪蛋白緩沖液1 mL迅速混勻，放入40 ℃水浴保溫10 min后，立即加入0.4 mol/L的TCA溶液2 mL終止反應，然后向1號管中加入1 mL的pH 7.0酪蛋白緩沖液，繼續保溫20 min，取出，在4 ℃，8000 r/min離心15 min去除固形物。分別移取上清液1 mL，加入0.4 mol/L的Na2CO3溶液5 mL和已稀釋的Folin-酚試劑1 mL，搖勻，置40 ℃水浴浸鍋中保溫發色20 min，用分光光度計在660 nm處測定吸光度值，以1號管做空白對照，樣品每次做3個平行，取平均值[13]。

1.3.2.4 酶活力定義

1 g成曲在40 ℃和pH值7.0條件下，1 min分解酪蛋白產生1 μg酪氨酸所需的酶量為1個中性蛋白酶活力單位(U)。

1.3.2.5 計算公式

中性蛋白酶活力(U)=A×K×N×4/10。

式中：A為樣品平行試驗的平均吸光度值；K為吸光常數；N為稀釋倍數；4為反應試劑的總體積；10為反應時間10 min。

2 結果與分析

2.1 高大毛霉接種量對成曲中性蛋白酶活力影響的試驗結果

采用制曲培養基紫蘇粕35 g、豆粕65 g、面粉18 g、料水比10∶8。pH自然，121 ℃滅菌25 min。曲料溫度自然降到32 ℃時,分別設定接菌量為2，3，4，5，6，7，8 mL/100 g接種高大毛霉1×106cfu/mL孢子懸液，在制曲溫度(28±1 )℃，制曲時間48 h，每12 h定時翻曲1 min條件下進行單因素試驗[14]，探究高大毛霉接種量對成曲中性蛋白酶活力的影響，結果見圖1。

圖1 高大毛霉接種量對成曲中性蛋白酶活力影響的試驗結果Fig.1 The experimental result for the impact of additive amount of Mucor mucedo on activity of neutral proteinase

由圖1可知，高大毛霉的接種量在2～5 mL/100 g時，隨著高大毛霉接種量的增加，成曲中性蛋白酶活力明顯提高，高大毛霉的接種量為5 mL/100 g時，中性蛋白酶活力達到 593.7 U/g，高大毛霉的接種量在5～8 mL/100 g時，隨著高大毛霉接種量的增加，成曲中性蛋白酶活力變化不明顯。因此，綜合考慮經濟效益，選擇成曲蛋白酶活力較高的高大毛霉接種量5，6，7 mL/100 g進行正交試驗。

2.2 制曲溫度對成曲中性蛋白酶活力影響的試驗結果

采用制曲培養基和單因素優化的接種量5 mL/100 g接種高大毛霉孢子懸液。分別設定制曲溫度為25，26，27，28，29，30，31 ℃[15]，制曲時間48 h，每12 h定時翻曲1 min條件下，探究制曲溫度對成曲中性蛋白酶活力的影響，結果見圖2。

圖2 制曲溫度對成曲中性蛋白酶活力影響的試驗結果Fig.2 The experimental result for the impact of koji-making temperature on activity of neutral proteinase

由圖2可知，制曲溫度在25～30 ℃時，隨著溫度的升高，成曲中性蛋白酶活力明顯提高，制曲溫度在30～31 ℃時，隨著溫度的升高，成曲中性蛋白酶活力明顯下降，因此，選擇成曲蛋白酶活力較高的3個制曲溫度28，29，30 ℃進行正交試驗。

2.3 制曲時間對成曲中性蛋白酶活力影響的試驗結果

在高大毛霉接種量5 mL/100 g，制曲溫度(30±1) ℃，每12 h定時翻曲1 min條件下，分別設定制曲時間為36，42，48，54，60，66，72 h時[16]，測定成曲的中性蛋白酶活力，探究制曲時間對成曲中性蛋白酶活力的影響，結果見圖3。

圖3 制曲時間對成曲中性蛋白酶活力影響的試驗結果Fig.3 The experimental result for the impact of koji-making time on activity of neutral proteinase

由圖3可知，中性蛋白酶活力隨制曲時間的變化規律，制曲時間在36～54 h時，隨著溫度的升高，成曲中性蛋白酶活力快速增加，制曲時間為54 h時，中性蛋白酶活力達到峰值659.1 U/g。制曲時間在54～72 h時，酶活力較高但緩慢下降，因此，選擇成曲中性蛋白酶活力較高3個制曲時間48，54，60 h進行正交試驗。

2.4 翻曲間隔時間對成曲中性蛋白酶活力影響的試驗結果

在相鄰2次翻曲時間間隔分別為3，6，9，12，15，18，21 h條件下制曲[17]，高大毛霉接種量5 mL/100 g、制曲溫度(30±1) ℃條件下，制曲時間為54 h，測定成曲的中性蛋白酶活力，探究翻曲間隔時間對成曲中性蛋白酶活力的影響，結果見圖4。

圖4 翻曲間隔時間對成曲中性蛋白酶活力影響的試驗結果Fig.4 The experimental result for the impact of koji-stirring interval time on activity of neutral proteinase

由圖4可知，翻曲間隔時間在3～12 h時，成曲中性蛋白酶活力變化不明顯，呈緩慢下降趨勢，翻曲間隔時間在12～21 h時，成曲中性蛋白酶活力迅速下降。選擇成曲中性蛋白酶活力較高的3個翻曲間隔時間6，9，12 h進行正交試驗。

2.5 優化制曲工藝條件的L9(34)正交試驗結果

選擇接種量、制曲溫度、制曲時間、翻曲間隔時間四因素的三水平設計正交試驗，測定成曲的中性蛋白酶活力，優化發酵生產風味紫蘇醬的制曲工藝條件，結果見表1。

表1 優化制曲工藝條件的L9(34)正交試驗結果Table 1 L9(34) orthogonal test results for optimization of koji-making conditions

續 表

由表1可知，各因素對成曲中性蛋白酶活力的影響大小順序依次為C>B>A>D，即制曲時間>制曲溫度>接種量>翻曲間隔時間。最佳方案為A2B2C2D1，即1×106cfu/mL高大毛霉孢子懸液接種量6 mL/100 g，制曲溫度29 ℃，制曲時間54 h，2次翻曲間隔時間6 h。

2.6 試驗驗證

為了驗證L9(34)正交試驗方法優化紫蘇粕和豆粕發酵生產紫蘇醬的制曲工藝的可行性，運用2.5正交試驗優化得到的制曲工藝參數，以中性蛋白酶活力為考察指標，試驗做3個平行。測得的中性蛋白酶活力為698.3 U/g，比優化前提高了17.62%，這說明采用L9(34)正交試驗方法優化紫蘇粕和豆粕發酵生產紫蘇醬的制曲工藝條件合理可行。

3 結論

采用單因素試驗設計和L9(34)正交試驗設計進行紫蘇粕和豆粕發酵生產紫蘇醬的制曲工藝條件優化，得到最優的工藝條件：1×106cfu/mL高大毛霉孢子懸液的接菌量6 mL/100 g，制曲溫度29 ℃，制曲時間54 h，翻曲間隔時間6 h。按照最優工藝條件進行紫蘇粕和豆粕發酵生產紫蘇醬的制曲，得到中性蛋白酶活力最高為698.3 U/g，比優化前提高了17.62%。

本研究采用正交試驗設計方法，與響應面優化方法相比具有一定的局限性[18]。下一步擬采用響應面優化法對制曲工藝進行優化，以便于得到更高的中性蛋白酶活力，為工業化生產提供工藝參數。

[1]李鵬，朱建飛，唐春紅，等.紫蘇的研究動態[J].重慶工商大學學報,2010,27(3):272-275.

[2]張洪，黃建韶，趙東海.紫蘇營養成分的研究[J].湖南文理學院學報(自然科學版),2006,18(1):49-51.

[3]鄭君.紫蘇子的研究[J].中國中醫藥資訊,2011(19):44-45.

[4]湯鳴強，鄭挺，曾小芳，等.釀造醬油米曲霉產中性蛋白酶的提取及酶學性質研究[J].中國調味品,2008(2):38-40.

[5]丁行勇，高慶華，葛飛.米曲霉固態發酵蘋果渣與棉粕生產中性蛋白酶的工藝優化研究[J].安徽工程科技學院學報,2010,25(2):18-21.

[6]劉瑩瑩，劉穎，張光.毛霉高產中性蛋白酶發酵培養基的優化[J].食品工業科技,2014,35(6):166-170.

[7]張昕，金銘，朱珠.響應面分析法優化風味紫蘇醬的制曲培養基[J].中國調味品,2016,41(1):19-22.

[8]鐘世榮，馮治平.黃豆甜面醬生產工藝研究[J].食品工業,2011(1):43-45.

[9]田海娟，冷進松.新型紫蘇調味豆醬的研究[J].食品科學,2010,31(23):331-334.

[10]林親錄，趙謀明，鄧靖，等.毛霉產蛋白酶的特性研究[J].食品科學,2005,26(5):44-46.

[11]潘進權.毛霉蛋白酶的催化特性及動力學研究[J].食品科技,2010,35(11):36-40.

[12]陳紅梅，潘力.米曲霉3.042種曲蛋白酶特性研究[J].中國調味品,2009,34(3):63-65.

[13]楊世平，邱徳全.米曲霉中性蛋白酶特性的研究[J].湛江海洋大學學報,2006,26(4):22-25

[14]楊世平，邱徳全.米曲霉產中性蛋白酶的適宜條件[J].湛江海洋大學學報,2005,25(3):47-51.

[15]吳建生，杜林，陳祖，等.影響豆醬制曲質量的因素及其優化控制[J].中國釀造,2008(4):50-52.

[16]何國慶，賈英民，丁立孝.食品微生物學[M].北京:中國農業大學出版社,2009.

[17]杜連祥，路福平.微生物學實驗技術[M].北京:中國輕工業出版社,2006.

[18]喬鑫，黃紅霞，喬羽，等.響應面分析法優化HS-SPME萃取黃豆醬揮發性成分工藝研究[J].食品科學,2010,31(22):69-73.