黏液型銅綠假單胞菌的毒力基因、產金屬酶檢測與耐藥性研究

謝國艷，高志生，李星軍，錢敏健，李小蘭

(1.上海交通大學醫學院附屬新華醫院崇明分院 檢驗科,上海202150；2.重慶市兩江新區第一人民醫院 檢驗科,重慶401121)

銅綠假單胞菌(PAE)是醫院感染的主要致病菌之一，根據其菌落形態及是否產生藻酸鹽形成生物膜分為黏液型和非黏液型。近年來黏液型PAE不斷增多，其易黏附在組織黏膜上并且不易被吞噬，使其逃避機體免疫清除和增強了對抗菌藥物的耐藥性[1]，常出現體外藥敏結果與臨床治療不一致的現象，而產金屬β-內酰胺酶(MBLs)且攜帶毒力基因的黏液型PAE菌株的不斷增多，更給臨床治療帶來更大的難題。PAE致病機制與Ⅲ型分泌系統(T3SS)密切相關[2]，T3SS主要分泌ExoS、ExoT、ExoY、ExoU 4種毒素，exoU和exoY具有快速而獨特的細胞毒作用，危害最大，exoS和exoT基因感染相對較輕，而ExoT是所有菌株都會產生的，因此本研究擬分析兩種表型PAE的毒力基因exoS、exoU、exoY的攜帶情況、MBLs的流行及耐藥情況，為本地區臨床診斷治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源 收集自我院2014年6月至2016年11月臨床非重復分離的200株PAE(篩選出82株黏液型和118株非黏液型菌株)，菌株經ATB細菌鑒定儀進行菌種鑒定，以甘油肉湯-20℃保存備用。銅綠假單胞菌ATCC 27853、肺炎克雷伯菌ATCC70063購自上海市臨檢中心。

1.1.2儀器及試劑 ATB細菌鑒定儀與ID 32 GN鑒定板(法國梅里埃)、7000型熒光定量PCR擴增儀(美國Applied Biosystems)、凝膠成像系統(美國BIO-RAD)、MH瓊脂平皿(上海科瑪嘉)、藥敏紙片(英國OXOID)；引物和探針及測序由上海生工公司完成。

1.2方法

1.2.1細菌鑒定及藥敏試驗采用ATB細菌鑒定儀進行菌種鑒定。表型分型則選取生長緩慢(35℃培養48 h后血平板可見濕潤、透明似小水滴樣、黏稠，麥康凱平板上形成無色半透明、嵌入培養基中不易挑起的黏液狀菌落)，進一步氧化酶陽性、挑絲試驗陽性者判定為黏液型PAE[3]。采用紙片擴散法進行藥敏試驗[4]，銅綠假單胞菌ATCC27853作為質控菌株。

1.2.2MBLs檢測 改良Hodge試驗(PAE-MHT)法[5]。

1.2.3毒力基因的檢測 根據參考文獻[6,7]設計引物(由上海博亞公司合成)。細菌DNA的制備采用煮沸裂解法，取上清液2 μl用于PCR擴增。PCR反應體積為50 μl，包括25 mmol/LMgCl24 μl，10×PCR緩沖液5 μl，上、下游引物各0.5 μl，dNTP 1 μl，Taq酶3 μl，模板2 μl，無菌蒸餾水34 μl，石蠟油覆蓋。擴增條件：94℃5 min；續以94℃30s；exoS、exoY和exoU退火溫度分別為55℃、55℃和59℃，30 s；72℃1 min,35個循環；72℃延伸5 min。取5 μl PCR產物采用20 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳分析。未加模板的無菌蒸餾水作為陰性對照。毒力基因引物序列和目的產物長度見表1。PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統觀察分析結果。選取擴增陽性產物純化后測序，結果與GeneBank中已知序列對比分析。

表1 引物序列表

1.2.4統計學分析 用SPSS 13.0軟件進行。組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1兩種表型的菌落對15種抗生素的耐藥情況見表2。

表2 不同表型對13種抗生素的耐藥情況(%)

2.2MBLs檢測PAE-MHT法檢測200株PAE，其中82株黏液型陽性率為3.7%(3/82)，118株非黏液型陽性率為13.6%(16/118)，非黏液型MBLs陽性率明顯高于黏液型(P<0.05)。

2.3毒力基因檢測PCR擴增82株黏液型的exoS、exoU、exoY，陽性率分別31.6%，12.7%，72.3%；118株非黏液型的exoS、exoU、exoY，陽性率分別23.3%，8.2%，65.1%。黏液型與非黏液型3種毒力基因陽性率均無顯著性差異(P>0.05)。幾個毒力基因電泳圖譜見圖1。

2.4基因型的分布共存在6種基因型，兩種表型菌株的基因型比較見表3。

3 討論

T3SS是PAE致病性的重要毒力系統，其中exoS和exoU的臨床意義尤為重要，Hauser等[8]研究顯示，exoU+為細胞毒型基因，表達蛋白exoU引起細胞壞死、凋亡，危害最大；exoS+為侵襲型基因，是PAE在感染過程中實現增殖和傳播的主要毒力因子，表達蛋白exoS能抑制宿主細胞吞噬作用、破壞肌動蛋白細胞骨架重排、導致細胞凋亡和抑制細胞分裂等，感染相對較輕；exoU+基因型的PAE毒力更強，感染后癥狀更嚴重，患者病死率更高。本研究共檢測3種毒力基因，獲得6種基因型。3種毒力基因陽性率黏液型均高于非黏液型，但兩者比較無顯著性差異；比較兩種表型的6種基因型，除exoU+/exoS-/exoY-和exoU-/exoS-/exoY-兩種基因型非黏液型明顯高于黏液型外，其余四種基因型的比較無顯著性差異。未發現三種基因同時存在或exoU、exoS這兩種基因同時存在的菌株，與exoS和exoU具有排它性、不同時存在于同一菌株的結論[9]相吻合。

注：M為DNA Marker(DL 1000)；3為陰性對照；5為陰性株；1，4為exoY基因陽性分離株；2，7，8為exoU基因陽性分離株；6為exoS基因陽性分離株。

表3 兩種表型菌株的基因型比較(%)

黏液型PAE是其在自然界中存在的一種特殊形式，非黏液型在一定的條件下可轉化成黏液型，其表面存在大量以多糖藻酸鹽為主要成分的黏液，從而可形成生物膜[10]。由于黏液型PAE生長緩慢，菌落黏稠，往往全自動儀器檢測藥敏失敗，因此本研究采用K-B法對兩種表型的PAE進行藥敏檢測。從表2看出，兩種表型的PAE對妥布霉素、亞胺培南、美羅培南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢吡肟的耐藥率較低(<20%)；其次為阿米卡星、慶大霉素、頭孢他啶、頭孢哌酮、左旋氧氟沙星(>20%)；而對氨曲南、哌拉西林的耐藥率較高(>40%)。對兩種表型的PAE耐藥性進行比較，發現非黏液型對各種抗生素的耐藥率均高于黏液型，其中慶大霉素、氨曲南和左氧氟沙星前者明顯高于后者，同時非黏液型對碳青霉烯類的耐藥率也明顯高于黏液型，這與非黏液型MBLs陽性率明顯高于黏液型相一致，也證實了產MBLs是PAE對碳青霉烯類抗菌藥物產生耐藥性的重要機制[5]。

筆者還發現，臨床反饋PAE根據藥敏譜選擇敏感抗生素后，非黏液型療效較好，而黏液型療效不佳。在對產黏液型的同一病人5天后再次進行耐藥監測，發現此表型的菌株藥敏譜變化不大，說明在短期內無新的耐藥機制產生，推測黏液型PAE體外實驗敏感而體內用藥無效的原因是因為生物被膜的形成阻擋抗生素對細菌起作用[11]。由于生物膜的特殊性，黏液型菌株比非黏液型定植更持久，感染更不易清除[12]。因此針對PAE感染，應盡早盡快選擇敏感藥物治療，以免非黏液型轉化成黏液型后，增加治療難度。

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