借助科研平臺開展基因工程實驗課教學(xué)改革探索與實踐

趙燕+黃麗華+張學(xué)文

摘要 基因工程實驗是基因工程課程教學(xué)的重要環(huán)節(jié)。本文基于對基因工程實驗教學(xué)內(nèi)容的整合和優(yōu)化，借助科研平臺優(yōu)勢進(jìn)行基因工程實驗教學(xué)改革探索與實踐，分析了教學(xué)改革成效與存在的不足，并提出相應(yīng)建議，以期調(diào)動學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣、培養(yǎng)學(xué)生的科研素質(zhì)、提高基因工程實驗課程教學(xué)質(zhì)量。

關(guān)鍵詞 科研平臺；基因工程；實驗課程；教學(xué)改革；成效；建議

中圖分類號 G642.0 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）24-0276-03

Exploration and Practice of Genetic Engineering Experiment Teaching Reform with Help of Scientific Research Platform

ZHAO Yan HUANG Li-hua ZHANG Xue-wen * LI Jian

（College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha Hunan 410128）

Abstract Genetic engineering experiment is an important part of genetic engineering course teaching.In this paper，based on the integration and optimization in genetic engineering experiment teaching content，exploration and practice of teaching reform of genetic engineering experiment was carried out with the advantage of scientific research platform，the results and shortcomings of the teaching reform were analyzed and the corresponding suggestions were put forward，so as to arouse the students′ interest in learning，cultivate the students′ scientific research quality and improve the teaching quality of the genetic engineering experiment course.

Key words scientific research platform；genetic engineering；experiment teaching；teaching reform；result；suggestion

以DNA重組技術(shù)為基礎(chǔ)的基因工程操作是當(dāng)今分子生物學(xué)研究的關(guān)鍵技術(shù)，基因工程作為一門實踐性和技術(shù)操作性都很強(qiáng)的課程，已經(jīng)成為國內(nèi)外高校生物技術(shù)、生物科學(xué)、生物工程、生物信息學(xué)等生物科學(xué)類本科生的核心主干課程[1-3]。而基因工程實驗教學(xué)是基因工程課程教學(xué)的重要內(nèi)容，課程教學(xué)的目標(biāo)更著重于培養(yǎng)學(xué)生掌握基因操作的技術(shù)，具備基因操作的能力。

隨著功能基因組時代的研究成果日新月異、基因編輯等研究熱點和新技術(shù)的出現(xiàn)，對生物技術(shù)人才的培養(yǎng)也提出了更高更新的要求，這一現(xiàn)狀使得國內(nèi)各高校都加強(qiáng)了對基因工程及其實驗課程的重視程度，不斷探索新的教學(xué)內(nèi)容和方法[4-5]。在校級精品課程和實驗教學(xué)改革項目的支持下，經(jīng)過幾年的探索和實踐，對基因工程的實驗教學(xué)內(nèi)容加以優(yōu)化，在設(shè)置課程實驗的基礎(chǔ)上，開設(shè)出連續(xù)性的綜合實驗，結(jié)合教學(xué)方法及教學(xué)組織形式上的改革，使基因工程實驗課程教學(xué)更有利于核心技能的學(xué)習(xí)和掌握，培養(yǎng)了學(xué)生的研究性學(xué)習(xí)能力，提高了基因工程實驗課程教學(xué)質(zhì)量[6]，已取得階段性成效。

為適應(yīng)基因工程技術(shù)飛速發(fā)展的形勢，合理構(gòu)筑學(xué)生理論和實踐知識結(jié)構(gòu)，使學(xué)生在有限的課時內(nèi)掌握完整的基因工程實驗操作技能，在上述教學(xué)改革的基礎(chǔ)上，近3年借助于科研平臺建立成熟的擬南芥、煙草、煙草BY2細(xì)胞系等植物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系。同時，依靠學(xué)校對本科生基因工程課程教學(xué)項目建設(shè)的支持，從2014年開始，嘗試將擬南芥、煙草、煙草BY2細(xì)胞系等模式植物的遺傳轉(zhuǎn)化引入本科生基因工程實驗教學(xué)項目，利用基因工程綜合實驗中構(gòu)建的多個植物表達(dá)載體，完成一系列系統(tǒng)完整的轉(zhuǎn)基因操作實驗。目前，這個實踐項目已經(jīng)實施了 3年，取得了可喜的成效，積累了可行性的經(jīng)驗。

1 轉(zhuǎn)基因受體材料的選擇

在轉(zhuǎn)基因受體材料的選擇上，考慮學(xué)生對轉(zhuǎn)化結(jié)果鑒定的直觀性和時效性，分別選擇了3種植物材料：①擬南芥（Arabidopsis thaliana），為十字花科蕓苔屬草本植物，屬自花受粉植物，一個生活世代只需60 d左右，植株小、收獲的種子多，容易獲得各種代謝功能的缺陷型，可以在培養(yǎng)皿滅菌條件下進(jìn)行相關(guān)性狀的篩選，其基因組小且基因高度純合，便于遺傳分析。②煙草（Nicotiana tabacum L.），是茄科一年生或有限多年生草本植物，作為最早用于植物組織培養(yǎng)及植株再生的模式植物，其繁殖系數(shù)大、抗病毒能力強(qiáng)、生長旺盛，非常適宜于開展遺傳轉(zhuǎn)化和瞬時表達(dá)實驗。③煙草BY2細(xì)胞（Nicotiana tabacum L.cv Bright Yellow 2，BY2）是生物學(xué)研究中非常重要且應(yīng)用廣泛的模式植物細(xì)胞，該細(xì)胞系具有高度的同一性，并且生長迅速，容易獲得具有高度同周期性的細(xì)胞，1周內(nèi)可以增加80～100倍，易于在實驗室內(nèi)培養(yǎng)繁殖和進(jìn)行轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灢僮鳎肄D(zhuǎn)基因細(xì)胞團(tuán)和懸浮培養(yǎng)細(xì)胞都較易得到，其轉(zhuǎn)化結(jié)果可通過熒光顯微鏡迅速觀察，便于轉(zhuǎn)基因結(jié)果分析。選擇上述3種材料進(jìn)行外源基因的轉(zhuǎn)化操作，可以讓學(xué)生以3種不同形式的受體類型（擬南芥植株、煙草葉盤組織器官、煙草BY2細(xì)胞系），掌握不同的遺傳轉(zhuǎn)化方法，分析不同類型的轉(zhuǎn)化結(jié)果。endprint

2 教學(xué)改革探索與實踐

基因工程課程通常安排在本科第6個學(xué)期開設(shè)。此前學(xué)生已經(jīng)完成了生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和普通遺傳學(xué)等基礎(chǔ)專業(yè)課程的學(xué)習(xí)。

2.1 基因工程綜合實驗的設(shè)計思路

將教師科研項目中研究比較成熟的部分改造成符合實驗教學(xué)要求的綜合性實驗項目，以基因表達(dá)框為基礎(chǔ)，引入啟動子和報告基因2個元件，實驗內(nèi)容從構(gòu)建含有外源目的基因的重組表達(dá)載體開始，主要包括重組表達(dá)載體的構(gòu)建、重組表達(dá)載體及空表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化、菌落PCR及酶切鑒定、工程農(nóng)桿菌的制備及受體材料的遺傳轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)基因材料的篩選鑒定。

2.2 改革措施

前期的課程改革，對基因工程的實驗內(nèi)容進(jìn)行整合和優(yōu)化，將20個學(xué)時的課程實驗和1.0～1.5周的綜合實驗設(shè)計成兩大板塊。一是上游操作包括目的基因的分離純化、載體的制備、重組分子的構(gòu)建、篩選及檢測等。利用20個學(xué)時的課程實驗，使學(xué)生掌握大腸桿菌等細(xì)菌的培養(yǎng)、基因組DNA提取、瓊脂糖凝膠電泳、PCR 擴(kuò)增目的基因、DNA的酶切與回收純化、目的基因與載體的連接、感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化等基礎(chǔ)的分子生物學(xué)實驗技術(shù)。二是下游板塊則在1.0～1.5周的綜合實驗期間與科研項目聯(lián)系起來，綜合為系統(tǒng)的、連貫的系列綜合性實驗。

2.3 典型案例

以模式植物擬南芥為例，具體過程如下。實驗使用2種啟動子的表達(dá)載體，一是組成型啟動子CaMV35S，二是參與花粉形成的調(diào)控并可在心皮進(jìn)行異位表達(dá)的組織特異表達(dá)啟動子AtTPD1pro，報告基因為GUS（β-葡萄糖苷酸酶基因）。以pCAMBIA1301-35S：：GUS載體為基礎(chǔ)，學(xué)生利用所學(xué)的DNA重組操作技術(shù)，將AtTPD1pro啟動子替換掉組成型CaMV35S啟動子，最終可得到2個載體pCAMBIA1301-35S：：GUS、pCAMBIA1301-AtTPD1pro：：GUS，轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌制備遺傳轉(zhuǎn)化的工程菌。采用經(jīng)典的浸花序法轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，實驗設(shè)置非轉(zhuǎn)基因材料對照和農(nóng)桿菌空載對照。通過對轉(zhuǎn)基因T0代種子的篩選及轉(zhuǎn)基因植株的GUS基因組織化學(xué)染色鑒定，轉(zhuǎn)化pCAMBIA1301-35S：：GUS載體的轉(zhuǎn)基因植株在各組織器官均有不同程度的GUS活性表達(dá)，而轉(zhuǎn)pCAMBIA1301-AtTPD1pro：：GUS載體的轉(zhuǎn)基因植株只在其花器官的雄蕊中有GUS活性表達(dá)，學(xué)生通過肉眼或?qū)嶓w顯微鏡觀察材料的染色情況，可以非常直觀地判斷外源基因是否整合和表達(dá)成功，比較組成型啟動子35S和組織特異性啟動子AtTPD1pro在基因表達(dá)上的差異，讓學(xué)生直觀地了解并掌握基因表達(dá)框中各個元件的作用。

在此基礎(chǔ)上，還將教師科研中利用生長素響應(yīng)原件（DR5）構(gòu)建的pBI121-DR5：：GUS、pBI121-DR5（Ω）：：GUS等重組表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌侵注（注射葉片）煙草葉片瞬時表達(dá)檢測法，將2個載體分別轉(zhuǎn)化煙草，2 d后切下侵染的葉盤進(jìn)行GUS染色分析，學(xué)生發(fā)現(xiàn)pBI121-DR5：：GUS的轉(zhuǎn)化葉片有明顯的藍(lán)色印跡，pBI121-DR5（Ω）：：GUS的轉(zhuǎn)化葉片卻無藍(lán)色印跡，其原因是GUS基因原有的5′UTR被來源于煙草花葉病毒的5′端序列（Ω）替換，該實驗讓學(xué)生真正理解了mRNA的有效翻譯是真核細(xì)胞基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟，即GUS的5′UTR序列在真核細(xì)胞中對mRNA翻譯起始的調(diào)控有重要作用，（Ω）序列即使是一種植物增強(qiáng)基因表達(dá)的常用原件，但如果該序列的插入破壞了原有基因的表達(dá)框架仍然不能有效提高GUS基因表達(dá)。同時，開發(fā)的煙草BY2細(xì)胞系的遺傳轉(zhuǎn)化也是綜合實驗中學(xué)生愿意選擇的一種重要的遺傳轉(zhuǎn)化方法。分泌載體蛋白SCAMP2（Secretory Carrier Membrane Protein 2）廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)膜及細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)，具有組成型的特點，直接參與膜泡運輸及跨膜活動，因而可以作為膜泡運輸研究的合適標(biāo)記。以分泌載體蛋白基因 SCAMP2與綠色熒光蛋白基因GFP融合構(gòu)建重組表達(dá)載體，采用根癌農(nóng)桿菌與煙草BY2 細(xì)胞系共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，通過對轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因BY2細(xì)胞系的熒光顯微觀察，學(xué)生直觀地觀察到GFP在細(xì)胞核附近、細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)、細(xì)胞質(zhì)膜及2個細(xì)胞間隔的組成型表達(dá)，而非轉(zhuǎn)基因的對照材料在熒光顯微鏡下卻沒有GFP的激發(fā)。

上述3種類型的遺傳轉(zhuǎn)化實驗在實驗周同時開展，學(xué)生根據(jù)課前實驗設(shè)計的方案和興趣選擇不同的實驗轉(zhuǎn)化小組，為避免學(xué)生選擇實驗類型的不均衡，擔(dān)任課程的2位實驗教師負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)，統(tǒng)籌合理安排每類實驗的人數(shù)，全班分成8～10個實驗小組，運用3種類型的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化3種不同的受體材料。實驗總課時為1.0～1.5周，為了這一綜合實驗項目的順利開設(shè)，在生物學(xué)實驗中心專門為本科生建立了植物生長馴化室，加之已有的無菌操作室、組織培養(yǎng)室、顯微鏡觀察室等。3年來，共對2012級、2013級、2014級生物技術(shù)、生物工程、生物科學(xué)3個專業(yè)16個班約540名學(xué)生開設(shè)了這一綜合實驗。實驗操作時，每個實驗班27～30人，學(xué)生每3個人分成一組操作，轉(zhuǎn)基因材料的管理和培養(yǎng)、種子收集、轉(zhuǎn)基因陽性后代的篩選鑒定等操作均由課程任課教師全程跟蹤指導(dǎo)，學(xué)生以組為單位負(fù)責(zé)完成，形成了以學(xué)生為主體、教師為主導(dǎo)的實驗教學(xué)模式。實驗課程改革還與基因工程理論課課程教學(xué)方法改革的重點項目結(jié)合在一起，利用翻轉(zhuǎn)課堂教學(xué)模式帶領(lǐng)學(xué)生參觀與科研平臺的協(xié)作單位湖南省棉花科學(xué)研究所的轉(zhuǎn)基因棉花基地，開展現(xiàn)場課程教學(xué)，學(xué)生通過參觀資源圃，考察和調(diào)查轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花田，了解了轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的選育歷程以及目前在生產(chǎn)中的應(yīng)用情況。現(xiàn)場教學(xué)以轉(zhuǎn)基因抗蟲棉為事例，以生產(chǎn)現(xiàn)場為教學(xué)場景，具有極為生動的教學(xué)效果，提高了學(xué)生的響應(yīng)度和參與積極性。

3 教學(xué)改革成效

將教師科研材料引入本科生基因工程實驗教學(xué)，實施3 年來成效十分明顯。一是這種多形式開放性的教學(xué)模式極大地激發(fā)了學(xué)生的實驗興趣和學(xué)習(xí)熱情，通過實驗提高了學(xué)生的團(tuán)隊意識和工作責(zé)任感，鍛煉了學(xué)生從事科研工作必須具備的基本素質(zhì)，且增強(qiáng)了學(xué)生之間的友誼和班級的凝聚力。二是通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥浸花序法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵注（葉片注射）煙草葉片瞬時表達(dá)檢測法、農(nóng)桿菌與煙草BY2細(xì)胞系共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法等不同的遺傳轉(zhuǎn)化方式的綜合實驗，學(xué)生親身經(jīng)歷從載體構(gòu)建到質(zhì)粒提取、受體準(zhǔn)備、各種遺傳轉(zhuǎn)化方法的具體操作和轉(zhuǎn)基因表型鑒定等各個環(huán)節(jié)的實踐操作，使學(xué)生們對基因工程操作的完整流程了然于心，通過實踐加深了對理論課知識的認(rèn)識和理解。三是轉(zhuǎn)基因煙草瞬時表達(dá)的檢測方法快速方便，鑒定直觀，當(dāng)學(xué)生完成轉(zhuǎn)基因操作2 d后，即可通過GUS組織化學(xué)染色，鑒定轉(zhuǎn)基因材料的結(jié)果。通過實體顯微鏡下染色部位觀察的差異性，明確地比較組成型啟動子和組織特異性啟動子驅(qū)動基因表達(dá)的不同功能，使學(xué)生消除了對轉(zhuǎn)基因的神秘感，增強(qiáng)了學(xué)生從事基因工程操作的自信心。四是3種不同的遺傳轉(zhuǎn)化方法和轉(zhuǎn)基因后代表型鑒定操作相對簡便、成功率高、時間短、操作可行性強(qiáng)。3種轉(zhuǎn)化方法都是科研平臺已建立的非常成熟的轉(zhuǎn)化體系，實驗中通過教師和平臺研究生的指導(dǎo)，轉(zhuǎn)基因后代的陽性率均較高。endprint

4 教學(xué)改革存在的不足及建議

4.1 實驗方案的設(shè)計和選擇方面

實驗方案和技術(shù)路線是實驗實施的藍(lán)本，等實驗周開始再讓學(xué)生進(jìn)行實驗設(shè)計，將會占用較多的實驗時數(shù)而影響實驗進(jìn)程。因此，從上理論課和課程實驗課開始就著手安排學(xué)生通過課程的數(shù)字化教學(xué)平臺、微信教學(xué)平臺及網(wǎng)絡(luò)資源查找相關(guān)文獻(xiàn)資料，熟悉實驗?zāi)康摹⒃O(shè)計要求和實驗內(nèi)容，學(xué)生以3人為1個實驗小組，利用課外時間進(jìn)行實驗設(shè)計，2位任課教師和學(xué)生共同對每個實驗小組展示的實驗方案進(jìn)行點評論證。通過實驗設(shè)計環(huán)節(jié)使學(xué)生在討論式的學(xué)習(xí)中有序梳理知識點，最終的實驗方案是經(jīng)點評論證后的優(yōu)化方案，每位同學(xué)對后續(xù)的綜合實驗內(nèi)容有一個初步了解。

4.2 實驗實施與實驗課時的安排方面

實驗實施集中在1.0～1.5周的綜合實驗周，而植物遺傳轉(zhuǎn)化實驗完成后，轉(zhuǎn)基因材料的后續(xù)培養(yǎng)、成熟、收種及轉(zhuǎn)基因材料的最終鑒定，由于每個小組的材料各異，時間上無法統(tǒng)一，有些實驗在規(guī)定的時間內(nèi)還無法完成。為解決這一矛盾，實行了包括周末在內(nèi)的全天候開放實驗室的措施，學(xué)生利用課余時間完成后續(xù)工作，同時任課教師輪值在實驗室實時指導(dǎo)學(xué)生。雖然這種工作模式較繁瑣且占用了教師和學(xué)生的課余時間，但由于整個實驗過程都是學(xué)生在實施自己的設(shè)計方案，且綜合實驗內(nèi)容的延展完成可以作為其畢業(yè)論文，因而學(xué)生利用業(yè)余時間完成實驗的積極性較高。綜合實驗全部完成后，教師召集全班同學(xué)集中總結(jié)，各抒己見，增強(qiáng)了學(xué)生做實驗的成就感、興趣和信心，激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)主動性。

4.3 實驗過程的管理方面

連續(xù)性的綜合實驗因?qū)I(yè)不同，每個班時間為1.0周或1.5周，耗時長，實驗材料多，實驗操作涉及植物生長室、組培室、無菌接種室、顯微鏡室、離心機(jī)室、凝膠成像室等多個專業(yè)儀器室和實驗室，給實驗教師的管理帶來一定難度。因此，在排課時與教務(wù)處協(xié)調(diào)，盡量不與其他課程沖突時間，實驗周期間全天候開放實驗室，課余時間任課教師輪值，保證實驗實施的有序進(jìn)行。

4.4 實驗經(jīng)費的支持方面

學(xué)院實驗中心是省重點實驗室，前期的課程教改建設(shè)已根據(jù)教學(xué)內(nèi)容對儀器設(shè)備進(jìn)行配套，添置了先進(jìn)、實用的新設(shè)備，提高儀器檔次和自動化程度，為基因工程實驗課程的開設(shè)和實踐教學(xué)搭建了堅實的平臺。但新型實驗的開發(fā)和實施需要一定實驗經(jīng)費的支持，原有的實驗經(jīng)費不能滿足需求。因此，積極申報課程改革項目，引導(dǎo)和鼓勵學(xué)生申報大學(xué)生科創(chuàng)項目，同時爭取科研平臺的實驗材料支持，使經(jīng)費缺口得到了較好的解決。

5 結(jié)語

總之，改革后的基因工程綜合實驗，讓學(xué)生親自參與實驗設(shè)計，將教師科研材料引入本科生實驗中，使學(xué)生非常直觀地理解掌握了基因工程的操作過程，激發(fā)了學(xué)生對科學(xué)研究的興趣，培養(yǎng)了學(xué)生良好的科研素質(zhì)，訓(xùn)練了學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒灹?xí)慣，為其進(jìn)一步深造打下了良好的基礎(chǔ)。多名考研成功的學(xué)生反映綜合性實驗的開展，使其對基因工程的實驗原理、技術(shù)操作流程有了深刻的理解和掌握，實驗技能得到了良好的訓(xùn)練，使其在研究生面試時得到導(dǎo)師的深度認(rèn)可。另外，在課程組教師指導(dǎo)下，近年有逾40名學(xué)生成功申請了國家級、省級、校級大學(xué)生創(chuàng)新研究項目的立項支持，其實驗結(jié)果發(fā)表研究論文逾10篇。教師的辛勤付出也得到學(xué)生的高度認(rèn)可，在學(xué)校對教師的評教體系中學(xué)生對教師的評教獲得了全優(yōu)。

經(jīng)過近3年的探索和實踐，開發(fā)教師科研材料引入本科生基因工程實驗課教學(xué)取得了一定的成效，構(gòu)建了一個課程教學(xué)和科研平臺相結(jié)合的課程教學(xué)模式和體系，也為培養(yǎng)具有創(chuàng)新能力、高素質(zhì)的復(fù)合型人才做出了有益的嘗試。

6 參考文獻(xiàn)

[1] 王忠華，斯越秀，俞超，等.“基因工程實驗技術(shù)”教學(xué)改革與探索[J].中國電力教育，2013（4）：136-140.

[2] 張萬方，孫寅瑋.分子與基因工程綜合實驗的教學(xué)改革[J].新鄉(xiāng)學(xué)院學(xué)報，2015，32（6）：74-76.

[3] 朱常香，王芳，李濱，等.一體化生物技術(shù)專業(yè)實驗課程體系的構(gòu)建與實踐[J].實驗室科學(xué)，2016，19（3）：76-78.

[4] 郜剛，李卉，智艷平，等.基因工程實驗課程改革探析與實踐[J].實驗科學(xué)與技術(shù)，2015，13（1）：6-59.

[5] 趙春梅，薛仁鎬，郭寶太.基因工程實驗教學(xué)的改進(jìn)與問題剖析[J].教育教學(xué)論壇，2015，50（12）：256-257.

[6] 趙燕，黃麗華，張學(xué)文.基因工程實驗課程教學(xué)內(nèi)容的優(yōu)化與實施[J].教育探索與實踐，2010，6（9）：15-17.endprint