激肽釋放酶KLK7小分子抑制劑的篩選及活性初步研究

王芳宇，戴俊斌，譚 瀟，何麗芳，王德平，李玉林

(1.衡陽師范學院 生命科學與環境學院，功能金屬有機材料湖南省重點實驗室，湖南 衡陽 421008；2.南華大學 藥學與生物科學學院，湖南 衡陽 421001；3.三峽大學 醫學院，湖北 宜昌 443002)

激肽釋放酶(Kallikreins,KLKs)是具有胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶特異性的絲氨酸蛋白酶，其編碼基因定位于19q13.4，編碼15個分泌型絲氨酸蛋白酶KLK 1-KLK 15[1]。已經證明，KLKs存在于正常人的皮膚角質層細胞中，目前發現，至少有8種KLK(KLK 5,KLK 6,KLK 7,KLK 8,KLK 10,KLK 11,KLK 13和KLK 14)存在于人的角質層和汗液中，其中KLK7占總量的40 %。KLK7可能是皮膚損傷的一個關鍵酶，而且在特應性皮炎(Atopic Dermatitis,AD)病人中它可能參與一個系統性炎癥反應，在AD的角質層KLK7升高最為突出[2]，這提示KLK7在AD的發病機制上可能是至關重要的，因此，抑制KLK7的活性對于AD的治療顯得最為重要。

本研究以KLK7作為靶分子，根據KLK7的晶體結構，采用美國ChemDiv化合物數據庫進行計算機模擬篩選，挑選能與KLK7催化域匹配結合的化合物(3 000個分子)，然后對3 000個分子進行人工挑選，挑選時綜合考慮化合物與靶蛋白的結合模式、預測的親合性數據以及成藥性指標，進一步得到300個分子。分析這300個分子對KLK7的抑制作用，以期得到具有較好抑制活性的小分子，作為AD治療的藥物先導化合物。

1 材料與方法

1.1 材料

有機化合物數據庫：ChemDiv 公司提供的有機小分子化合物篩選庫，約含 105萬個有機小分子化合物。

小分子化合物：美國TOPSCIENCE公司；

激肽釋放酶7(Recombinant Human Kallikrein 7 ：R&D； MCa-R-P-K-P-V-E-Nval-W-R-K(Dnp)-NH2：R&D；

多功能熒光酶標儀：Bio-tek公司(美國)。

1.2 方法

1.2.1 計算機虛擬篩選

以KLK7作為靶分子，根據KLK7的晶體結構，采用美國ChemDiv化合物數據庫 (1 044 623個分子)進行計算機模擬篩選。分兩步進行，第一步基于藥效團模型進行篩選，共得到342 366個化合物；第二步，對獲得的化合物進行分子對接篩選，挑選與KLK7催化域匹配結合效果好的化合物(3 000個分子)(虛擬篩選委托上海陶素生化技術有限公司完成)。

1.2.2 人工挑選

對虛擬篩選中排名靠前的3 000個化合物進行人工挑選，挑選時綜合考慮化合物與靶蛋白的結合模式、預測的親合性數據以及成藥性指標。最終挑選匹配效果最好的前300個化合物分子(Top300)進行后續的研究。

1.2.3 Top300小分子化合物對KLK7的抑制效果分析

KLK7分別與小分子化合物在37 ℃下作用15分鐘，然后加入KLK7的熒光底物MCa-R-P-K-P-V-E-Nval-W-R-K(Dnp)-NH2，15分鐘(37 ℃)后測酶活性。不含小分子化合物的為陰性對照，計算抑制率=(1-a/b)×100 %，a為待測樣品的酶活，b為陰性對照的酶活。

1.2.4 化合物IC50的測定

選取抑制率高的化合物設置成6.5、12.5、25、50、100和200 μM等6個濃度梯度，分別與KLK7 在37 ℃下作用15分鐘，然后加入KLK7的熒光底物MCa-R-P-K-P-V-E-Nval-W-R-K(Dnp)-NH2，15分鐘(37 ℃)后測酶活性。

2 結 果

2.1 Top300小分子化合物的獲得

重新dock Top3000分子，得到Score和RMSD值。Score代表對docking的打分，Score值越小越好。RMSD代表dock后分子構象與起始構象的差別。對Score值根據分子量作修正，得到revised Score值。以revised Score為X軸，RMSD值為Y軸作圖，如圖1。在圖1作輔助線，以輔助線為軸，越靠近圖表左下方的分子，它的Score值與RMSD值越小，分子預測效果越好。反之，越靠近右上方的分子它的Score值與RMSD值越大，分子預測效果越差。將所有分子的坐標投影到輔助線上得到projection value，然后排序，挑選Top300個分子 (表1)。

圖1 revised Score與RMSD值之間呈微弱正相關

表1 挑選的Top300分子

續表

續表

NameWeight/DaRankNameWeight/DaRankD463?0253425 5499E612?0534423 51249F109?1335413 51100Y020?1010421 49250G284?1264401 5101E225?0558510 58251E223?0621504 58102C677?0059445 58252C592?3493485 6103F154?0022518253C753?1688438 56104C260?1232528 6254F594?0887463 611055498?2769490 57255E984?2605465 98106F036?0047469 58256K630?0051471 48107D715?1638400 47257C260?1644534108E225?1022526 65258F142?0451516 56109C064?0446567 74259K284?2518525 62110E228?2761430 47260F036?0054455 55111G907?1193490 61261P349?2557439 87112K405?1719445 44262K242?1041461 51113G213?0382435 58263G381?0202419 54114F680?0588463 98264G696?5989460 54115G622?0932431 46265E223?0887505 03116C241?1975536 62266F109?1495413 51117C445?0306556 61267F120?0101418 92118G696?5717442 55268G319?0120497 61119F036?1966488 55269K286?3997565 691205228?0720394 49270F142?0534455 55121F154?0371524 63271F796?0212431 491226850?0227467 63272E756?0186495 56123C260?1089563273G015?1221497 631244013?0064436 5274C260?2081549 02125G819?0203485 6275C753?0532437 53126F061?1420511 61276F936?0671452 56127G907?1361490 61277F036?1054457 5128C796?0561527 68278F111?1301423 51129K784?5776421 53279C260?1473542 63130E856?3076487 59280C260?2165530 66131G581?0417459 582815055?9164486 57132C800?0835394 53282C880?1473480 56133M461?3026491 97283C880?0756493 6134G803?0555409 43284C064?0047591 74135E228?2817448 53285L112?0742470 59136G629?0241546 66286G546?0749486 01137D223?0658478 5287E856?3108487 59138G932?0753436 51288C879?2400402 53139D704?3047407 472893172?0923482 531401682?8193477 9290E524?1745491 58141G534?0683474 572914013?2686486 63142G572?0184456 56292E225?0740508 61143L690?0717484 55293G581?0361485 53144E002?1609454 56294F142?0652518 631456466?0688475 51295F512?0798411 47146G725?1800436 49296F509?0474464 94147C064?0268504 55297D335?3106386 51148K808?7972371 47298E717?0330485 621494424?0480483 56299G581?0358455 55150C155?0523540 74300

2.2 Top300小分子化合物對KLK7的抑制效果

1) 200 μM濃度下篩選得到13個對KLK7抑制效率為100 %的化合物，編號分別是26,44,47,52,54,63,73,125,138,165,166,251,260；

2)將上步篩選到的13個化合物的反應濃度降低至50 μM，檢測它們在50 μM濃度時對KLK7的抑制效率，發現44號化合物在50 μM時對KLK7沒有抑制作用，其余12個化合物依然有抑制作用但抑制效率下降，其中%inhibition在50 %以上的化合物有5個，編號分別為47,54,125,166,260。

表 2 50 M濃度下13個化合物對KLK7的抑制率

注：*表示%Inhibition>50

2.3 抑制率高的五個化合物對KLK7的IC50

進一步研究50 μM濃度下對KLK7的抑制率>50 %的五個化合物對KLK7的抑制效率，根據測得的F.U/h計算出%inhibition，再根據% inhibition和抑制劑濃度用KaleidaGraph軟件進行曲線擬合，計算各個抑制劑對KLK7的IC50(其中54號化合物抑制效果檢測不理想，結果沒有列出)。結果顯示，47號、125號、166號和260號化合物對KLK7的IC50依次是：37.166 μM，25.32 μM，28.955 μM，36.078 μM。

表3 47號化合物檢測數據

表4 125號化合物檢測數據

表5 166號化合物檢測數據

表6 260號化合物檢測數據

3 討 論

近年來，使用信息工具進行藥物設計和虛擬篩選在短時間內來獲得藥物先導化合物越來越受到重視。計算機工具發現新藥先導化合物的應用可幫助研究人員迅速設計和評估新的藥物。計算機資源減少了獲得藥物的時間和相關經濟成本，使得在低成本下有靶標性地預測潛在藥物成為可能[3]。

虛擬篩選依賴分子模擬技術，從大量的有機化合物中遴選出可能有效的候選化合物，避免了對化合物的盲目篩選，從而大大降低了發現活性先導化合物的成本。近些年來，國內外針對一些重大疾病藥物靶標均有許多成功使用虛擬篩選的實例[4]。從原理上來講，虛擬篩選可以分為兩類，即基于分子對接的虛擬篩選和基于藥效團的虛擬篩選。基于分子對接的虛擬篩選從靶蛋白的三維結構出發，研究靶蛋白結合位點的特征性質以及它與小分子化合物之間的相互作用模式，根據與結合能相關的親合性打分函數對蛋白和小分子化合物的結合能力進行評價，最終從大量的化合物分子中挑選出結合模式比較合理的、預測得分較高的化合物，用于后續的生物活性測試?；谒幮F的虛擬篩選一般是利用一系列已知活性的小分子化合物產生一個與藥物作用對應的藥效團模型，然后根據這個模型在化合物數據庫中搜索能夠與它匹配的化學分子結構，最后對這些挑選出來的化合物進行實驗篩選研究。

本實驗選用的有機化合物數據庫ChemDiv 數據庫，是由 ChemDiv 公司提供的有機小分子化合物篩選庫，是目前世界上提供數量最多，結構具有豐富多樣性的化合物庫。采用的藥物分子設計軟件GOLD (GOLD 軟件套裝5.2版,由英國Cambridge Crystal Data Center發行)是由 Sheffield 大學，GlaxoSmithKline 公司和 Cambridge Crystallographic Data Center(CCDC)共同開發的對接程序[5]。它采用遺傳算法產生小分子配體的結合構象，分子對接時配體是完全柔性的，蛋白分子可以考慮部分柔性。GOLD 程序自帶多種打分函數，包括GoldScore[6]、ChemScore[7]、ASP[8]。新版中整合了打分函數ChemScore_Kinase 和ChemScore_PLP。

本實驗通過篩選得到的300個小分子化合物，進一步檢測抑制效率較高的化合物并測定其對KLK7的IC50。其中47號、125號、166號和260號化合物對KLK7的IC50依次是：37.166 μM，25.32 μM，28.955 μM，36.078 μM，說明這四個化合物對KLK7有較好的抑制作用，可以進一步研究。

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(編校 陳志陽)