MSI及其相關調控蛋白對治療Ⅱ～Ⅲ期散發性結直腸癌療效及預后影響的臨床研究

孫琦 俞一峰

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年8月～2012年6月在江陰市人民醫院行手術治疔的結直腸癌患者, 年齡25～85歲, 平均年齡(61.5±10.1)歲。隨訪采用門診復查、電話、書信、電子郵件等方式進行。無病生存期定義根治性治療后到腫瘤復發或因各種原因出現死亡的時間, 以月為單位計算。至研究終點(2017年5月)。其中具有完整隨訪資料者138例, 隨訪時間(43.9±21.6)個月。

1.2 MSI檢測

1.2.1 核酸提取 血液標本：采用新景血液提取試劑盒；DNA無需稀釋, 直接用于聚合酶鏈反應(PCR)。石蠟標本：采用QIAGEN石蠟提取試劑盒；DNA稀釋至20 ng/μl用于PCR的模板。核酸定量：使用Qubit進行核酸定量。

1.2.2 試劑 引物為NR-21、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26, 產物長度分別為110 bp、132 bp、154 bp、123 bp、122 bp, 修飾方法分別為5'-FAM、5'-FAM、5'-HEX、5'-TMR、5'-HEX。

1.2.3 操作步驟 反應體系的配制：以一個位點的體系配制為例。從-20℃冰箱中取出試劑以及待檢樣品DNA, 待其融化后, 短暫離心, 將管壁和管蓋上的液體收集到管底。在試劑準備區配制20 μl PCR反應體系, 各組分及添加量如下。

1.2.4 PCR擴增 在擴增區按如下的反應條件進行PCR擴增 ：94℃ 4 min, 94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s 10 個循環 ,94℃ 30 s、53℃ 30 s、72℃ 30 s 30 個循環 , 72℃ 30s, 10℃ ∞。

1.2.5 瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果 取3 μl PCR擴增產物混合2 μl loading buffer, 在1.5%瓊脂糖凝膠上直接點樣, 120 V電泳20 min, 于凝膠成像儀下觀察結果。

1.2.6 混合各位點PCR產物送毛細管電泳分析 將血液和石蠟樣本五個位點的PCR產物分別混合成一管約15 μl的混合物, 各位點PCR產物的添加量視電泳條帶亮度而定, 若五個位點條帶亮度一致, 則添加比例為1∶1∶1∶1∶1；若條帶亮度有差異, 則根據實際情況適當調整添加比例, 條帶較亮的可適當減少添加量, 反之, 條帶較暗的則可適當增加添加量。將混合好的產物外送進行毛細管電泳分析, 送上海生工生物測序。

1.3 免疫組化檢測四種MMR蛋白 10%中性磷酸緩沖福爾馬林固定24～48 h, 常規脫水、固定、石蠟包埋, 免疫組化檢測四種MMR蛋白。①MLH1, 兔單抗, 克隆號ES05, 即用型；②PMS2, 兔單抗, 克隆號EP51, 即用型；③MSH2, 兔單抗,克隆號FE11, 即用型；④MSH6, 兔單抗, 克隆號EP49, 即用型；上述一抗均為SANTA CRUZ公司。所用二抗是DAKO EnVision TM二步法抗兔、鼠通用型免疫組化試劑, 所用免疫組花儀是DAKO AutostainerLink 48。每張切片含有正常腸黏膜、腫瘤周圍組織、炎性組織作為內對照。判斷標準為內對照細胞核陽性而癌組織全陰性(即沒有1個細胞核染色)時, 表面該蛋白表達缺失［1,2］。兩名病理科主治以上醫師閱片,如果有分歧, 請第三名高年資病理科醫師裁決。

1.4 觀察指標 比較138例患者基因檢測同免疫組化檢測結果, MSI-H腫瘤的影響因素, MSI與術后化療的關系。

1.5 統計學方法 采用SPSS19.0統計學軟件處理數據。計量資料以均數±標準差( x-±s)表示, 采用t檢驗；計數資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。用Kaplan-Meierk生存曲線進行生存率估計, 以Log-rank進行生存率的比較, P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基因檢測同免疫組化結果 基因檢測103例MSS, 4例為MSI-L, 而免疫組化檢測發現MSI-H, 免疫組化顯示4例中PMS2缺失2例, MSH2缺失1例, MSH6缺失1例。

2.2 MSI檢測基本特征 31例(22.5%)為MSI-H, 36例(26.1%)為MSI-L, 71例(51.4%)為MSS。通過MSI分析, MSI-H男女比例為11∶20；18例≤65歲, 13例＞65歲；腫瘤分期Ⅱ期19例, 腫瘤分期ⅢA期10例, 腫瘤分期ⅢB期2例；有無癌結節比例為0∶31；有無脈管侵犯比例為3∶28；有無神經侵犯比例為2∶29；有無淋巴結有無轉移比例為12∶19；右半結腸9例, 左半結腸3例, 直腸 19例；組織學類型：非黏液癌23例, 黏液癌8例；CEA：26例≤5, 5例＞5。MSIL+MSS的男女比例為46∶61；63例≤65歲, 44例＞65例；腫瘤分期Ⅱ期73例, 腫瘤分期ⅢA期22例, 腫瘤分期ⅢB期12例；有無癌結節比例為7∶100；有無脈管侵犯比例為8∶99；有無神經侵犯比例為3∶104；有無淋巴結有無轉移比例33∶74；右半結腸18例, 左半結腸4例, 直腸85例；組織學類型：非黏液癌81例, 黏液癌 26例；CEA：90例≤5, 17例＞5。MSI-H腫瘤在性別、年齡、腫瘤分期、組織學分型、CEA升高與否、腫瘤部位、淋巴結是否轉移、神經侵犯與否、脈管侵犯與否、有無癌結節同MSI-L和MSS腫瘤相比, 差異均無統計學意義(P＞0.05)。

2.3 MSI與術后化療的關系 Ⅱ期MSI-H化療9例, 未化療10例；Ⅱ期MSI-L或MSS化療44例, 未化療29例。Ⅲ期化療38例, 未化療8例。Ⅱ期中MSI-L或MSS患者卡培他濱(希羅達)單藥化療、FOLFOX4、XELOX方案, 5年生存率分別為66.7%(6/9)、57.7%(15/26)、77.8%(7/9), 比較差異無統計學意義(P＞0.05)；Ⅲ期患者希羅達單藥化療、FOLFOX4、XELOX方案,五年生存率分別為27.3%(3/11), 26.1%(6/23), 50.0%(2/4), 比較差異無統計學意義(P＞0.05)。MSI-H 31例, MSI-L、MSS共107例, 兩組患者5年無病生存率分別為71.0%(22/31)和44.9%(48/107), 比較差異有統計學意義(P＜0.05)。Ⅱ期MSI-L或MSS患者化療后5年生存率為63.6%(28/44)明顯高于未化療41.4%(12/29), 差異有統計學意義(P＜0.05)。

3 討論

本次研究中, Ⅱ期中MSI-L或MSS患者中有7例有神經脈管侵犯、癌結節等多種高危因素行化療, 僅有2例存活高于5年, 1例有高危因素者未化療。說明Ⅱ期結直腸惡性腫瘤有相關高危因素預后不佳［3-5］。如果去除有該高危因素, 將剩下的Ⅱ期檢測為MSI-L或MSS病例進行統計, Ⅱ期MSI-L或MSS患者化療后5年生存率為63.6%(28/44)明顯高于未化療41.4%(12/29), 差異有統計學意義(P＜0.05)。本研究納入的化療方案有三種, 分別為希羅達單藥化療、FOLFOX4、XELOX, 研究顯示Ⅱ期和Ⅲ期三種化療方案間比較, 差異無統計學意義(P＞0.05)。既往研究認為5-FU 聯用其他化療藥物時, 會改變 MSI 對化療藥物的預測價值, 尤其是加入 dMMR 結直腸癌敏感的奧沙利鉑, FOLFOX 化療方案的結直腸癌中 MSI 可能是預后良好的一種標志, 尤其是Ⅲ期。但因為本研究中Ⅲ期患者總共有46例, 其中XELOX方案化療僅4例, 樣本量較少, 與相關研究結果不符, 結果不一定客觀準確, 需進一步增加樣本量, 以作進一步研究。

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