黑果枸杞酚性成分研究△

程禮芝，郭平霞，戴偉峰，晏永明，劉寶華，王淑美，程永現，*

（1.廣東藥科大學，廣東 廣州 510006；2.深圳大學醫學部藥學院，廣東 深圳 518060；3.中國科學院昆明植物研究所植物化學與西部植物資源持續利用國家重點實驗室，云南 昆明 650201；4.深圳大學醫學部生物化學與分子生物學系，廣東 深圳 518060）

黑果枸杞Lycium ruthenicum Murr.為茄科枸杞屬多年生灌木，簡稱黑枸杞，果實黑色，是一種藥食兩用植物，在我國主要分布于西北地區，尤以青海產的質量最優。藏藥稱黑果枸杞為 “旁瑪”，其味甘、性平，清心熱，用于治療心熱病、心臟病、月經異常、停經等病癥，民間常生食或榨汁做飲料，具有滋補強壯、明目及降血壓作用［1-2］。現代藥理研究表明，黑果枸杞具有抗氧化、抗衰老、提高免疫力等作用［2-5］。其化學成分研究比較薄弱，已有研究主要集中于花色苷、原花青素、生物堿類和酚性化合物［2-8］。黑果枸杞含有豐富的維生素、礦物質等營養成分，其原花青素含量很高，是目前發現的天然野生果實中花青素含量最高的植物，原花青素具有很好的清除自由基和抗氧化作用，因此黑果枸杞近年來在保健品開發市場異常活躍［9］，逐漸被公眾所熟知，其價格也是不斷上漲。由于野生資源的匱乏，人工栽培種植也逐漸成規模，這為充分利用這一天然資源提供了保障。鑒于此，本研究主要對黑果枸杞物質基礎進行研究，從中共分離鑒定化合物14個，其中化合物1～4、7、9和14為首次從該植物中分離得到，并對化合物1和2進行了抗衰老相關因子SIRT1和SIRT6的體外活性測試。

1 儀器與材料

薄層色譜硅膠GF254（青島海洋化工廠）；MCI gel CHP 20P（75～150μm，日本三菱公司）；Sephadex LH-20（25～100μm，Pharmacia公司）；RP-18（40～63μm，日本 Daiso）；北京創新通恒 LC3000型HPLC和Agilent 1200型HPLC，半制備色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×9.4 mm，5μm）和YMC-Pack-ODS-A（250 mm×10 mm，5μm）；Bruker AvanceⅢ400MHz、500MHz和Bruker Avance 600 MHz核磁共振儀（TMS為內標）；Xevo TQ-S超高壓液相色譜三重四級桿串聯質譜聯用儀；PerkinElmer En-Spire型多通道酶標儀；SIRT1 Fluorometric Drug Discovery Kit（Enzo公司）；CycLex SIRT6 Deacetylase Fluorometric Assay Kit（MEDICAL＆ BIOLOGICAL LABORATORIES，MBL公司）。

黑果枸杞樣品由青海大可生物科技有限公司提供，經云南省藥物研究所高級工程師邱斌鑒定為黑果枸杞Lycium ruthenicum Murr.的干燥果實，憑證標本（編號：CHYX0605Q）保存于中國科學院昆明植物研究所植物化學與西部植物資源持續利用國家重點實驗室。

2 方法

2.1 提取與分離

黑果枸杞5 kg，80%乙醇水回流提取（3×2 h），每次6倍體積，提取液用鹽酸調pH為1～2，依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取，各3次，分別記為A和B部分。A部分（52.5 g）經MCI gel CHP 20P柱（甲醇-水，10%～100%）分為7段（F1～F7）。F1（1.5 g）經Sephadex LH-20（甲醇）色譜得3個組分（F1.1～F1.3）。F1.1（500 mg）經制備薄層色譜 ［三氯甲烷-甲醇-甲酸（8∶1∶0.1）］再行半制備 HPLC［乙腈-水（含5‰甲酸），20%］得化合物8（3 mg）、2（1.1 mg）和 7（7.9 mg）。F1.2（500 mg）經制備薄層色譜 ［三氯甲烷-甲醇-甲酸（8∶1∶0.1））再行半制備 HPLC［甲醇-水（含5‰甲酸），45%］得化合物1（2.4 mg）和 9（3.7 mg）。F4（2.5 g）經 Sephadex LH-20（甲醇）色譜得6個組分（F4.1～F4.6）。F4.1（600 mg）經制備薄層色譜 ［三氯甲烷-甲醇-甲酸（9∶1∶0.05）］得 5個組分（F4.1.1～F4.1.5），F4.1.4（50 mg）經半制備HPLC（乙腈-水，15%）得化合物10（2 mg）、4（4.1 mg）和3（2.5 mg）。F4.1.5（80 mg）經半制備 HPLC（乙腈-水，20%）得化合物12（1.6 mg）、13（4.5 mg）和14（3.5 mg）。F4.3（200 mg）經制備薄層色譜 ［三氯甲烷-甲醇-甲酸（8∶1∶0.1）］，再行半制備 HPLC（乙腈-水，25%）得化合物 5（2.2 mg），6（2.4 mg）和 11（1.9 mg）。

2.2 SIRT1體外活性測試

本實驗利用SIRT1 Fluorometric Drug Discovery Kit以檢測化合物對SIRT1體外活性的影響。首先，配制含0.5 U（1 U＝1 pmol·min-1，37℃）SIRT1（除空白組外），1000μmol·L-1NAD+，100μmol·L-1去乙酰酶底物，SIRT1緩沖液（50 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0，137mmol·L-1NaCl，2.7mmol·L-1KCl，1 mmol·L-1MgCl2，1 mg·mL-1BSA）的體系。實驗組加入待檢測化合物，使化合物終濃度為200μmol·L-1，空白組與對照組加入等量溶解化合物的溶劑；再加入已配好的體系，使加入待檢測化合物與體系的總體積為25μL。37℃條件下孵育30 min后于每個孔中加入1×Fluor de Lys developer solution（含有2 mmol·L-1煙酰胺）25μL終止反應，反應在半區96孔板中進行。多功能酶標儀360 nm激發光，460 nm發射光條件下測取各孔熒光值。

2.3 SIRT6體外活性測試

本實驗利用CycLex SIRT6 Deacetylase Fluorometric Assay Kit檢測化合物對SIRT6體外活性的影響。檢測體系中含2.5μL帶有熒光基團和淬滅基團的底物多肽（0.1mmol·L-1），2.5μL NAD（8mmol·L-1），2.5μL Developer，2.5μL重組 SIRT6（空白組除外）以及2.5μL SIRT6實驗緩沖液。實驗組加入待檢測化合物，使化合物終濃度為200μmol·L-1，反應體系總體積為25μL。空白與對照組加入等量的溶解化合物的溶劑，實驗在半區96孔板中進行。多功能酶標儀于37℃、490 nm激發光，530 nm發射光條件下測取各孔熒光值。

3 結果

3.1 化合物結構鑒定

化合物1：淡黃色固體，ESI-MS：m／z299［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：9.81（1H，s，H-7′），7.55（1H，brs，H-2′），7.42（1H，brs，H-6′），6.97（1H，d，J＝1.6 Hz，H-2），6.85（1H，d，J＝8.0，1.6 Hz，H-6），6.81（1H，d，J＝8.0 Hz，H-5），5.69（1H，d，J＝6.5 Hz，H-7），3.89（2H，d，J＝5.9 Hz，H-9），3.96（3H，s，5′-OCH3），3.85（3H，s，3-OCH3），3.64（1H，m，H-8）。以上數據和文獻基本一致［10］，故確定化合物1為榕醛。

化合物2：淡黃色固體，ESI-MS：m／z345［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：6.23（1H，d，J＝1.9 Hz，H-3），6.01（1H，d，J＝1.9 Hz，H-5），4.90（1H，overlap，H-1′），3.90（1H，dd，J＝12.2，1.5 Hz，Ha-6′），3.87（3H，s，7-OCH3），3.71（1H，dd，J＝12.2，4.8 Hz，Hb-6′），3.30～3.52（4H，overlap，H-2′，3′，4′，5′）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：98.7（C-1），164.8（C-2），96.6（C-3），165.0（C-4），98.3（C-5），161.2（C-6），172.0（C-7），102.5（C-1′），74.9（C-2′），78.0（C-3′），71.2（C-4′），78.4（C-5′），62.4（C-6′），52.6（7-OMe）。以上數據和文獻基本一致［11］，故確定化合物2為4，6-二羥基苯甲酸甲酯-2-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物3：淡黃色固體，ESI-MS：m／z177［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.78（1H，d，J＝9.4 Hz，H-4），6.94（1H，s，H-5），6.75（1H，s，H-8），6.18（1H，d，J＝9.4 Hz，H-3）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：164.3（C-2），112.8（C-3），146.1（C-4），112.5（C-4a），113.0（C-5），144.6（C-6），152.1（C-7），103.6（C-8），150.5（C-8a）。以上數據和文獻對照基本一致［12］，故確定化合物3為馬栗樹皮素。

化合物4：淡黃色固體，ESI-MS：m／z325［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.73（1H，d，J＝15.8 Hz，H-7），7.48（2H，d，J＝8.5 Hz，H-2，H-6），6.81（2H，d，J＝8.5 Hz，H-3，H-5），6.37（1H，d，J＝15.8 Hz，H-8），5.57（1H，d，J＝7.6 Hz，H-1′），3.85（1H，dd，J＝12.2，1.9 Hz，Ha-6′），3.69（1H，dd，J＝12.2，4.6 Hz，Hb-6′），3.30～3.48（4H，overlap，H-2′，3′，4′，5′）。以上數據和文獻對照基本一致［13］，故確定化合物4為對羥基肉桂酸葡萄糖酯。

化合物5：淡黃色固體，ESI-MS：m／z193［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.59（1H，d，J＝15.8 Hz，H-7），7.18（1H，d，J＝2.0 Hz，H-2），7.06（1H，dd，J＝8.2，2.0 Hz，H-6），6.81（1H，d，J＝8.2 Hz，H-5），6.31（1H，d，J＝15.8 Hz，H-8），3.89（3H，s，3-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：167.5（s，C-9），149.3（s，C-3），147.8（s，C-4），145.2（d，C-7），126.3（C-1），123.4（C-6），115.2（C-5），114.7（C-8），110.0（C-2），55.6（3-OCH3）。以上數據和文獻對照基本一致［14］，故確定化合物5為反式阿魏酸。

化合物6：淡黃色固體，ESI-MS：m／z179［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.53（1H，d，J＝15.8 Hz，H-7），7.04（1H，d，J＝2.0 Hz，H-2），6.93（1H，dd，J＝8.2，2.0 Hz，H-6），6.78（1H，d，J＝8.2 Hz，H-5），6.22（1H，d，J＝15.8 Hz，H-8）。以上數據和文獻對照基本一致［15］，故確定化合物6為反式咖啡酸。

化合物7：淡黃色固體，ESI-MS：m／z177［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.63（1H，d，J＝15.9 Hz，H-7），7.47（2H，d，J＝8.6 Hz，H-2，H-6），6.82（2H，d，J＝8.6 Hz，H-3，H-5），6.34（1H，d，J＝15.9 Hz，H-8），3.77（3H，s，4-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：172.2（C-9），160.3（C-4），145.4（C-7），131.2（C-2，C-6），128.5（C-1），117.1（C-8），114.9（C-3，C-5），56.3（4-OCH3）。以上數據和文獻對照基本一致［16］，故確定化合物7為對甲氧基桂皮酸。

化合物8：淡黃色固體，ESI-MS：m／z163［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.55（2H，d，J＝8.6 Hz，H-2，H-6），6.90（2H，d，J＝8.6 Hz，H-3，H-5），7.62（1H，d，J＝16.0 Hz，H-7），6.34（1H，d，J＝16.0 Hz，H-8）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：126.3（C-1），130.0（C-2，C-6），115.3（C-3，C-5），157.8（C-4），145.2（C-7），114.7（C-8），167.5（C-9）。以上數據和文獻對照基本一致［14］，故確定化合物8為對羥基桂皮酸。

化合物9：淡黃色固體，ESI-MS：m／z209［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：6.77（1H，d，J＝1.6 Hz，H-2），6.69（1H，d，J＝8.0 Hz，H-5），6.62（1H，dd，J＝8.0，1.6 Hz，H-6），3.84（3H，s，3-OCH3），3.63（3H，s，9-OCH3），2.59（2H，t，J＝7.6 Hz，H-8），2.87（2H，t，J＝7.6 Hz，H-7）。以上數據和文獻基本一致［17］，故確定化合物9為二氫阿魏酸甲酯。

化合物10：淡黃色固體，ESI-MS m／z：167［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.44（1H，dd，J＝7.5，1.6 Hz，H-6），6.74（1H，d，J＝7.5 Hz，H-5），7.54（1H，d，J＝1.6 Hz，H-2），3.85（3H，s，3-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：122.2（C-1），113.7（C-2），149.4（C-3），147.6（C-4），114.8（C-5），123.9（C-6），171.2（C-7），56.1（3-OCH3）。以上數據和文獻對照基本一致［18］，故確定化合物10為香草酸。

化合物11：淡黃色固體，ESI-MS：m／z 153［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.45（1H，d，J＝1.9 Hz，H-2），7.43（1H，dd，J＝8.0，1.9 Hz，H-6），6.81（1H，d，J＝8.0 Hz，H-5）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：121.7（C-1），122.5（C-2），144.7（C-3），150.1（C-4），114.3（C-5），116.3（C-6），168.8（C-7）。以上數據和文獻對照基本一致［19］，故確定化合物11為原兒茶酸。

化合物12：白色固體，ESI-MS：m／z137［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.83（1H，d，J＝7.4 Hz，H-2，H-6），6.76（1H，d，J＝7.4 Hz，H-3，H-5）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：128.0（C-1），132.4（C-2，C-6），115.4（C-3，C-5），161.3（C-4），171.2（C-7）。以上數據和文獻對照基本一致［20］，故確定化合物12為對羥基苯甲酸。

化合物13：淡黃色固體，ESI-MS：m／z137［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：9.69（1H，s，H-7），7.30（1H，dd，J＝1.9 Hz，H-2），7.28（1H，d，J＝7.8，1.9 Hz，H-6），6.91（1H，d，J＝7.8 Hz，H-5）。以上數據和文獻對照基本一致［21］，故確定化合物13為原兒茶醛。

化合物14：白色固體，ESI-MS m／z：129［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：6.81（1H，d，J＝15.9 Hz，H-3），6.76（1H，d，J＝15.9 Hz，H-2），3.79（3H，s，1-OCH3）。以上數據和文獻對照基本一致［22］，故確定化合物14為（E）-2-丁烯二酸單甲酯。

3.2 活性測試

對抗衰老的自然過程一直是人類科學研究的焦點，黑果枸杞主要用于抗氧化和抗衰老，對其的開發和利用引起了人們廣泛關注和重視。近年來發現長壽基因SIRT1去乙酰化酶在延緩生物體衰老過程中扮演著十分重要的角色，SIRT6通過干預基因組的穩定性而影響衰老進程，由于化合物3～13的結構為常見酚性化合物，因此，我們僅對分離得到的化合物1和2進行了SIRT1和SIRT6體外活性測試，遺憾的是，這兩個化合物并未顯示活性。鑒于黑果構杞本身對抗衰老的作用，因此可以預見其中的其他化合物可能是其抗衰老的物質基礎。

4 結論與討論

黑果枸杞的開發利用近年逐漸升溫，其甚至被譽為 “軟黃金”美譽，但是其藥效物質基礎研究還很薄弱，我們本次報道分離得到的14個酚性化合物，其中化合物1～4、7、9和14為首次從黑果枸杞中分離得到，此外對化合物1和2也進行了抗衰老相關的SIRT1和SIRT6體外活性測試，雖然未顯示出相關活性，可以預見其中的其他化合物可能是其抗衰老的物質基礎，值得進一步挖掘。

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