尋常性銀屑病患者表皮中DNA甲基化轉移酶2和3amRNA的表達

毛旭華 欒超 胡煜 董卉妍 蔣明軍 陳敏

214200江蘇，宜興市人民醫院檢驗科（毛旭華）；中國醫學科學院 北京協和醫學院皮膚病研究所（欒超、胡煜、蔣明軍、陳敏）；徐州醫科大學（董卉妍）

近年研究發現，DNA甲基化異常在銀屑病發病機制中起一定作用。DNA甲基化轉移酶（DNMT）是一類在DNA甲基化過程中起重要調控作用的酶，在真核生物中它分為3個家族，即DNMT1、DNMT2和DNMT3。DNMT1在銀屑病皮損中異常表達［1］，而DNMT2和DNMT3a在胃癌組織中均有異常表達［2］。本研究采用實時定量PCR技術檢測銀屑病患者表皮中DNMT2和DNMT3a的表達，探討DNMT2和DNMT3a與銀屑病發病機制的關系。

一、資料和方法

1.臨床資料：入選標準：尋常性斑塊狀銀屑病患者，年齡18～65歲，4周內未系統用藥物，2周內未外用藥物，不伴感染、其他自身免疫性疾病及腫瘤。46例銀屑病患者來自2009年3月至2010年12月中國醫學科學院皮膚病醫院皮膚科及宜興市人民醫院皮膚科門診。全部為蘇皖地區漢族人。男33例，女13例；年齡18～65歲，病程1～30年，銀屑病皮損面積和嚴重程度指數（PASI）5.1～46.2。25例為進行期，21例為穩定期。46例患者同時采集皮損及周圍外觀正常皮膚。28例對照組標本來自中國醫學科學院皮膚病醫院皮膚外科美容手術切除的蘇皖地區健康漢族人正常皮膚，男21例，女7例。銀屑病組和對照組間年齡和性別分布差異無統計學意義（均P＞0.05）。本研究已獲中國醫學科學院皮膚病醫院和宜興市人民醫院醫學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

2.主要試劑和儀器：分散酶（美國Roche公司），RNA提取和純化試劑盒（美國Qiagen公司），逆轉錄試劑盒（美國Promega公司），Hot Taq DNA聚合酶（美國Promega公司）。引物由南京金斯瑞生物工程技術服務有限公司合成，其序列為：DNMT2正向引物 5′?AAGCTGTAAGCCAGCCCATATA?3′，反向5′?TCAGCAGTGAACAGAACCTACATG?3′，片段長度148 bp；DNMT3a正向引物5′?TTCTACCGCCTCCTGCATGAT ?3′，反向5′?GCGAGATGTCCCTCTTGTCACTA ?3′，片段長度113 bp；內參照β肌動蛋白正向引物5′?CAGTCGGTTGGAGC GAGCAT ?3′，反向5′?GGACTTCCTGTAACAACGCATCT ?3′，片段長度112 bp。ABI7500實時定量PCR儀為美國ABI公司產品。

3.標本采集和真表皮分離：用6mm環鉆分別鉆取銀屑病患者皮損和皮損邊緣3 cm外的正常皮膚（非皮損），置-80℃冰箱中保存備用。0.25%分散酶消化患者及對照皮膚標本16～20 h，分離出表皮，置于用焦碳酸二乙酯水處理過的玻璃研磨器中勻漿化。

4.實時定量PCR檢測皮膚組織中DNMT2和DNMT3a mRNA：取勻漿按照Qiagen公司說明書提取總RNA，檢測RNA的含量和純度。按照逆轉錄試劑盒說明書操作合成cDNA。產物置-20℃保存待PCR擴增。實時定量PCR擴增反應體系包括2倍RTmix 12.5μl，模板（cDNA稀釋10倍）2μl（0.2μmol/L），2μmol/L正向和反向引物各2.5μl，加無核酸酶水至25μl。短暫離心后上樣，每個樣本做3個復孔。反應條件為：95℃預變性2 min，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個循環。熔解曲線分析：溫度60℃～95℃，溫度間隔0.3℃，時間為5 s。ΔCt為目的基因與內參基因的Ct差值。通過2?ΔΔCt將mRNA表達數據轉化為線性形式進行統計分析。

5.統計學分析：采用SPSS 11.5軟件包進行統計分析，組間比較采用獨立樣本t檢驗，顯著性檢驗水平為0.05。

二、結果

1.表皮DNMT2mRNA的表達：銀屑病組與對照組表皮均檢測出DNMT2 mRNA表達。皮損、非皮損和對照組DNMT2mRNA表達水平（2?ΔΔCt值）分別是0.62 ± 0.02、0.36 ±0.05和0.15±0.11，皮損組明顯高于非皮損組（t=6.23，P＜0.01），非皮損組明顯高于對照組（t=7.33，P＜0.01）。

2.表皮DNMT3amRNA的表達：銀屑病組與對照組表皮均檢測出DNMT3amRNA表達。患者皮損、非皮損和對照組表皮中 DNMT3amRNA 表達水平（2?ΔΔCt值）分別是 0.85 ±0.03、0.43±0.04和0.18±0.09，皮損組明顯高于非皮損組（t=5.66，P ＜0.01），非皮損組明顯高于對照組（t=8.62，P ＜0.01）。

三、討論

我們曾在銀屑病皮損中發現，P16基因啟動子區域甲基化異常，50%啟動子CPG島發生甲基化改變［3］。在銀屑病患者皮膚中，甲基化轉移酶DNMT1和MeCP2均存在異常表達［1］，HLA I類分子C位點啟動子區域甲基化異常［4］。

本研究發現，銀屑病患者皮損表皮中DNMT2和DNMT3amRNA表達明顯高于非皮損表皮，且非皮損表皮又高于正常對照組。而之前的研究發現，銀屑病皮損中DNMT1mRNA的表達低于正常對照組，而另一種重要的DNA甲基化酶MeCP2mRNA的表達高于正常對照組［1］。有報道銀屑病患者外周血單一核細胞中DNMT1高表達，MeCP2 低表達，未發現DNMT3a和DNMT3b異常表達［5］。由此推斷，銀屑病患者皮損與外周血中各甲基化相關基因的表達并不一致。