光動(dòng)力療法單用或聯(lián)合抗真菌藥物對(duì)游離態(tài)及形成生物膜的皮炎外瓶霉凋亡的影響

徐玉亭 鄭文倩 高露娟 孫毅 李琳蕓 李明 曾同祥

434100湖北荊州，長江大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（徐玉亭、鄭文倩）；復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院皮膚科（高露娟、李明）；長江大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院附屬荊州市中心醫(yī)院皮膚科（孫毅、曾同祥），檢驗(yàn)科（李琳蕓）

皮炎外瓶霉感染治療棘手，臨床中采用兩性霉素B、伏立康唑及伊曲康唑治療的成功率只有44%、50%和71.4%［1-2］。真菌生物膜的形成是感染播散、耐藥及治療效果差的重要原因之一［3］。多項(xiàng)研究證實(shí)，皮炎外瓶霉能夠形成生物膜，且對(duì)常規(guī)抗真菌藥物耐藥［4-5］。近年來，抗微生物光動(dòng)力療法已被證明對(duì)多種致病性真菌有體外殺傷作用，同時(shí)在臨床中也已成功用于著色芽生菌病、甲真菌病等的輔助治療［6］。我們前期研究證實(shí)，光動(dòng)力療法能高效殺傷游離態(tài)及形成生物膜的皮炎外瓶霉，且與抗真菌藥物具有協(xié)同殺傷效應(yīng)［5］。在此研究基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步探索光動(dòng)力療法單獨(dú)或聯(lián)合抗真菌藥物對(duì)游離態(tài)及形成生物膜的皮炎外瓶霉凋亡發(fā)生的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)菌株

皮炎外瓶霉臨床分離株ATCC34100（北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科李若瑜教授惠贈(zèng)），實(shí)驗(yàn)前用沙氏培養(yǎng)基活化1周，以保證受試真菌的活力及純度。

二、實(shí)驗(yàn)用藥

伊曲康唑（批號(hào)84625-61-6，純度＞99%）、伏立康唑（批號(hào)137234-62-9，純度＞99%）、兩性霉素B（批號(hào)1397-89-3，純度 ＞80%）均為美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，泊沙康唑（批號(hào)S1257，純度 ＞99%）為美國Selleck chemicals公司產(chǎn)品，各藥物儲(chǔ)存液濃度均為1 600 mg/L。光動(dòng)力療法光敏劑為亞甲藍(lán)（美國Sigma-Aldrich公司，批號(hào)1001968916），工作液濃度為8 mg/L。

三、制備游離態(tài)孢子懸液

將活化后的皮炎外瓶霉接種于沙氏培養(yǎng)基7 d，用含0.03%Triton的無菌蒸餾水收集孢子，以血細(xì)胞計(jì)數(shù)板將孢子濃度調(diào)至1×106/ml～5×106/ml，然后用RPMI 1640液體培養(yǎng)基稀釋100倍，27℃，于搖床180 r/min（離心半徑為20 mm）振蕩孵育48 h，收集孢子，用生理氯化鈉溶液制作孢子懸液，濃度為1×106/ml～5×106/ml。

四、構(gòu)建皮炎外瓶霉生物膜

通過改良的96孔板法［3］構(gòu)建。制備1×107/ml孢子懸液，在96孔板每孔中加入200 μl上述菌懸液，于37℃培養(yǎng)72 h。去掉上層培養(yǎng)基，避免破壞底部的生物膜，并用無菌磷酸鹽緩沖液清洗3次以去除懸浮的孢子。

五、藥物及光動(dòng)力處理

皮炎外瓶霉游離態(tài)孢子與生物膜分別均分為單藥組、光動(dòng)力組、光動(dòng)力聯(lián)合藥物組以及空白對(duì)照組。藥物包括兩性霉素B、伏立康唑、伊曲康唑和泊沙康唑。單藥組用制備好的游離態(tài)菌懸液和生物膜分別接受4種抗真菌藥物處理，藥物工作濃度均為1 mg/L，處理時(shí)間均為2 h。光動(dòng)力組：向皮炎外瓶霉游離態(tài)孢子和生物膜中加入亞甲藍(lán)，工作濃度8 mg/L，用光動(dòng)力治療儀（機(jī)型C86C15100338，深圳普門科技有限公司）照射［波長（635±10）nm］2 min，然后37℃避光孵育2 h。光動(dòng)力聯(lián)合藥物組：皮炎外瓶霉游離態(tài)孢子和生物膜經(jīng)過上述光動(dòng)力處理后，分別加入伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素B和泊沙康唑并孵育2 h，藥物終濃度均為1 mg/L。空白對(duì)照組不加藥物，不進(jìn)行光動(dòng)力處理，僅在37℃孵育2 h。

六、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）法檢測細(xì)胞凋亡

采用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Alexa Fluor 488，上海翊圣生物科技有限公司）檢測，按說明書進(jìn)行。用EpicsXL流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司）在（520±20）nm波長熒光下觀察綠色熒光，在＞620 nm波長的熒光下觀察碘化丙錠（PI）染色后的紅色熒光。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0軟件進(jìn)行析因方差分析，組間多重比較采用LSD檢驗(yàn)。用GraphPad PRISM軟件進(jìn)行圖表統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、光動(dòng)力療法及抗真菌藥物對(duì)游離態(tài)皮炎外瓶霉凋亡的影響

析因方差分析顯示，不同的抗真菌藥對(duì)游離態(tài)皮炎外瓶霉凋亡率有顯著影響（F=16.326，P＜0.001），光動(dòng)力療法對(duì)其凋亡亦有影響（F=112.321，P＜0.001），光動(dòng)力療法與抗真菌藥對(duì)游離態(tài)皮炎外瓶霉凋亡無交互作用（F=1.776，P=0.173）。

空白對(duì)照組和兩性霉素B、泊沙康唑、伏立康唑、伊曲康唑單藥組凋亡率分別為11.67%±0.21%、13.30%±1.78%、14.30%±3.61%、14.51%±1.91%、36.17%±4.00%，其中伊曲康唑單藥組凋亡率顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05），兩性霉素B、泊沙康唑及伏立康唑單藥組與空白對(duì)照組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.458、0.242、0.210）。

光動(dòng)力組凋亡率為41.37%±7.80%，顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05）。光動(dòng)力聯(lián)合兩性霉素B、泊沙康唑、伏立康唑、伊曲康唑組凋亡率分別為29.23%±6.71%、37.23%±10.86%、43.57%±6.42%、69.87%±3.53%，其中，光動(dòng)力聯(lián)合伏立康唑組及伊曲康唑組凋亡率均分別顯著高于伏立康唑及伊曲康唑單藥組（均P＜0.05）。光動(dòng)力聯(lián)合伊曲康唑組凋亡率顯著高于光動(dòng)力組（P＜0.05），而光動(dòng)力聯(lián)合兩性霉素B、泊沙康唑、伏立康唑組凋亡率與光動(dòng)力組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

二、光動(dòng)力療法及抗真菌藥物對(duì)形成生物膜的皮炎外瓶霉凋亡的影響

析因方差分析顯示，不同的抗真菌藥對(duì)形成生物膜的皮炎外瓶霉凋亡率有顯著影響（F=5.591，P=0.030），光動(dòng)力療法對(duì)其凋亡亦有影響（F=20.466，P＜0.001），光動(dòng)力療法與抗真菌藥對(duì)形成生物膜的皮炎外瓶霉凋亡無交互作用（F=2.25，P=0.065）。

空白對(duì)照組、兩性霉素B、泊沙康唑、伏立康唑、伊曲康唑單藥組凋亡率分別為25.30%±1.31%、29.90%±3.91%、33.67%±9.03%、38.87%±4.89%、46.13%±6.81%，伏立康唑、伊曲康唑組顯著高于空白對(duì)照組（P=0.042、0.005）。

光動(dòng)力組凋亡率為32.00%±0.43%，顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05）。光動(dòng)力聯(lián)合兩性霉素B（62.63%±10.79%）、泊沙康唑（43.20%±2.87%）、伏立康唑（49.83%±3.38%）、伊曲康唑組凋亡率（56.73%±5.24%）均較相應(yīng)單藥組有所升高，其中光動(dòng)力聯(lián)合兩性霉素B組凋亡率顯著高于兩性霉素B單藥組（P＜0.05）。光動(dòng)力聯(lián)合兩性霉素B、泊沙康唑、伏立康唑、伊曲康唑組凋亡率均顯著高于光動(dòng)力組（均P＜0.05）。

討 論

在病原真菌感染方面，光動(dòng)力療法被認(rèn)為是一種極具潛力的無創(chuàng)性替代治療方案。體外研究證明，光動(dòng)力對(duì)念珠菌、皮膚癬菌、申克孢子絲菌、鐮刀菌、裴氏著色霉及卡氏枝孢瓶霉等致病真菌有殺傷作用［7-10］。在臨床上，光動(dòng)力療法已成功用于治療甲真菌病、著色真菌病等，并取得良好的療效［11-13］。此外，光動(dòng)力還能抑制對(duì)常規(guī)藥物耐藥的真菌生物膜［14］。

我們的前期研究顯示，皮炎外瓶霉生物膜對(duì)常用抗真菌藥物不敏感，唑類藥物（伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑）和兩性霉素B對(duì)皮炎外瓶霉生物膜的50%最小抑菌濃度（SMIC50）分別≥16 mg/L和1～2 mg/L，80%最小抑菌濃度分別≥16 mg/L和4～8 mg/L［5］。然而，以亞甲藍(lán)為光敏劑的光動(dòng)力療法不僅能高效殺傷皮炎外瓶霉游離態(tài)孢子和生物膜，還能顯著增加其對(duì)抗真菌藥物的敏感性［5］。

基于以往的研究結(jié)果，我們進(jìn)一步探索光動(dòng)力單用或聯(lián)合抗真菌藥物對(duì)游離態(tài)及形成生物膜的皮炎外瓶霉凋亡發(fā)生的影響。結(jié)果顯示，抗真菌藥物雖然能一定程度上增加皮炎外瓶霉游離態(tài)孢子和生物膜的凋亡率，但與對(duì)照組相比，差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；相反，光動(dòng)力療法能夠顯著增加游離態(tài)及形成生物膜的皮炎外瓶霉的凋亡率。而且，光動(dòng)力聯(lián)合藥物組與單藥組相比，凋亡率也明顯增加，提示誘導(dǎo)凋亡發(fā)生可能是光動(dòng)力對(duì)皮炎外瓶霉殺傷的重要機(jī)制之一。因此，聯(lián)合光動(dòng)力療法能增強(qiáng)抗真菌藥物對(duì)皮炎外瓶霉的促凋亡作用，本研究打破了抗真菌藥物單獨(dú)治療皮炎外瓶霉的局限性，為皮炎外瓶霉感染的治療提供了新的思路。

本研究還提示，光動(dòng)力聯(lián)合藥物組游離態(tài)皮炎外瓶霉凋亡率比單藥組均有所升高，但除伊曲康唑外其他抗真菌藥與光動(dòng)力聯(lián)合組與光動(dòng)力組卻無明顯差異，提示兩性霉素B、泊沙康唑、伏立康唑這幾種抗真菌藥物對(duì)皮炎外瓶霉凋亡發(fā)生無明顯作用。而就皮炎外瓶霉生物膜來說，光動(dòng)力聯(lián)合各藥物組凋亡率不僅比相應(yīng)單藥組明顯升高，較光動(dòng)力組也均明顯升高。可見，光動(dòng)力聯(lián)合抗真菌藥物對(duì)游離態(tài)及形成生物膜的皮炎外瓶霉凋亡的影響存在一定的差異，而造成這種差異的潛在機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

本研究采用TUNEL試劑盒聯(lián)合流式細(xì)胞儀來檢測細(xì)胞凋亡，該方法有一定局限性，只能識(shí)別凋亡細(xì)胞，無法識(shí)別壞死細(xì)胞。我們推測，光動(dòng)力和藥物均能誘導(dǎo)皮炎外瓶霉凋亡或壞死，其中抗真菌藥物更容易造成皮炎外瓶霉的壞死，而光動(dòng)力更容易誘導(dǎo)其凋亡的發(fā)生。抗真菌藥物聯(lián)合光動(dòng)力時(shí)，可能造成壞死率上升，而凋亡率下降。其具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本研究初步探索抗真菌藥物及光動(dòng)力對(duì)游離態(tài)及形成生物膜的皮炎外瓶霉凋亡發(fā)生的影響，并證實(shí)光動(dòng)力能夠顯著促進(jìn)游離態(tài)及形成生物膜的皮炎外瓶霉凋亡，這可能是光動(dòng)力對(duì)游離態(tài)及形成生物膜的皮炎外瓶霉的重要?dú)麢C(jī)制之一。然而，光動(dòng)力與藥物聯(lián)合的機(jī)制較為復(fù)雜，尚需進(jìn)一步研究。