環磷酰胺聯合白頭翁多糖體內抗乳腺癌作用初探

劉娟 杜凌艷（通訊作者）

（樂山市人民醫院 四川 樂山 614000）

乳腺癌作為一種全球女性發病率最高的惡性疾病，除早期患者選擇單一的手術或放射治療可達到治愈目的外，目前乳腺癌已進入綜合治療時代，中、晚期患者均采取手術、化療及放療結合治療。環磷酰胺作為常用烷化類抗腫瘤化療藥物，在治療惡性腫瘤、免疫性相關及器官移植等疾病中發揮重要作用。近幾年，一些研究者發現高等植物提取的多糖具有抗腫瘤活性，且抗腫瘤活性與其增強免疫功能有關[1]。又因中醫藥安全、有效、副作用小的特點，研究者們開始將中國傳統中醫藥作為新的抗腫瘤藥物進行研究，天然植物防治乳腺癌的臨床與實驗研究正逐步引起世人的關注[2-3]。

白頭翁（Radix Pulsatillae）清熱解毒、涼血止痢，現代醫學證實[4]其具有抗炎、抗菌、抗腫瘤及調節免疫的作用。目前對白頭翁的抗腫瘤藥理作用研究成為焦點[5]。

1.材料

動物：BALB/c小鼠，SPF級，雌性，體重18～20g，購于軍事醫學科學院實驗動物中心（SCXK-（軍）2016-004）。

細胞株：4T1乳腺癌細胞，購于中國醫科院腫瘤細胞庫。

試驗用藥：環磷酰胺（CTX），上海華聯制藥有限公司產品（批號：20160916）；白頭翁草藥由本院中藥房提供，符合國家藥典正品標準。

2.方法

2.1 白頭翁多糖的提取

多糖提取時由于真空濃縮，產品黏著于瓶子內壁，造成收率較低，利用無水乙醇進行改良提取[6]。

取粉碎好的白頭翁100g，浸泡1h，3次煎煮（100℃，6h/次）后過濾，常壓濃縮至2/3體積，2500r/min離心30min，收集上清。真空濃縮后再次離心，待濃縮液成為糖漿狀后轉移至離心管，以無水乙醇少量多次溶解掛壁糖漿，并收集在同一離心管，靜置30min離心，冷凍干燥至恒重，得白頭翁多糖RP。

2.2 4T1細胞培養和乳腺癌荷瘤小鼠模型的建立[7]

以RPMI-1640培養基（胎牛血清10%；青霉素、鏈霉素100μg/ml）培養4T1腫瘤細胞，每隔3至4天分瓶傳代，將處于對數生長期的腫瘤細胞用于體內腫瘤的接種。PBS重懸細胞，濃度為1x107/ml，100ul/只，接種于實驗動物右側脅肋處。

2.3 實驗分組及給藥

待腫瘤體積長至100mm3時隨機分為四組：空白對照組（Vehicle），CTX（25mg/kg）組，CTX+RPL（25+50mg/kg）和CTX+RPH（25+100mg/kg）組，每組10只。RP灌胃給藥，CTX腹腔注射，連續給藥12天，Vehicle組灌服等劑量蒸餾水。

2.4 觀察指標

每天稱量小鼠體重，每周三次游標卡尺測量腫瘤的長、短徑，體積計算公式為：體積=0.536×長徑×短徑2，繪制小鼠體重及腫瘤體積變化圖[8]。

實驗結束時剝離瘤體，稱重，計算抑瘤率[10]；解剖獲得脾臟、胸腺，對其進行重量分析，計算脾臟（胸腺）指數[9]。

2.5 統計學方法

應用統計學SPSS 17.0軟件進行數據分析[11]，單因素方差解析，以P＜0.05表示具有統計學意義。

3.結果

3.1 體重分析

給藥過程中，動物一般狀態良好，未表現明顯的體重降低。給藥6天至實驗結束，由于腫瘤體積的迅速增長，各治療組體重均顯著低于Vehicle組（P＜0.05），且CTX與CTX+RPH組間，體重差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 實驗動物體重變化曲線

3.2 腫瘤體積變化

給藥一周后，各治療組表現出明顯的抗腫瘤活性（P＜0.01），但各組間無顯著性差異；實驗結束時，各治療組腫瘤體積顯著低于Vehicle組，且與CTX組相比，CTX+RPL、CTX+RPH組抗腫瘤作用差異具有統計學意義（P＜0.01），CTX+RPL、CTX+RPH組間抗腫瘤作用差異具有顯著性（P＜0.05），見圖2。

圖2 腫瘤生長曲線

3.3 瘤重及抑瘤率

與Vehicle組相比，各治療組腫瘤重量均顯著降低（P＜0.01），抑瘤率明顯提高（P＜0.05，P＜0.01）；此外，與CTX組比較，CTX+RPH組腫瘤重量顯著降低（P＜0.05），抑瘤率明顯升高（P＜0.05）；與CTX+RPL組相比，CTX+RPH組抑瘤率差異不明顯，整體趨勢與腫瘤體積基本一致，見表1。

表1 腫瘤重量及抑瘤率

3.4 脾臟及胸腺指數

與Vehicle組相比，CTX治療導致各組小鼠的脾臟及胸腺指數水平明顯降低，而RP參與治療可逆轉此趨勢，其中CTX+RPH組對脾臟指數的升高具有顯著性差異（P＜0.05）。RP對胸腺指數水平雖有一定程度的升高，但此升高作用無統計學意義，見表2。

表2 各組脾臟指數及胸腺指數

4.討論

此研究探討環磷酰胺聯合白頭翁多糖對4T1乳腺癌移植瘤模型的抗腫瘤活性，結果表明環磷酰胺對小鼠乳腺癌抑瘤作用明確，白頭翁多糖能夠提高環磷酰胺的抗腫瘤作用，而且在一定程度上提高了小鼠的免疫力。

當代社會乳腺癌嚴重危害著女性的身心健康，對其研究已經成為人類社會關注的焦點。環磷酰胺作為廣譜的抗癌藥物，能夠明顯抑制腫瘤生長，但其免疫抑制作用應引起重視，即殺傷腫瘤的同時對正常組織器官造成不同程度的損傷。本研究亦證明，環磷酰胺對荷瘤鼠的免疫器官（脾臟、胸腺）有較強的抑制作用，因此，尋找一種能夠實現增效減毒作用的輔助藥物具有重要意義。

研究報道[12-13]顯示，白頭翁多糖具有一定的抗腫瘤活性，并拮抗CTX導致的吞噬功能抑制。本研究顯示，單用CTX組荷瘤鼠脾臟和胸腺指數明顯下降，與白頭翁多糖聯合用藥后，增強抑瘤作用的同時，脾臟和胸腺得到了緩解，且在一定的濃度范圍內，白頭翁多糖給藥量越高，指數提高越顯著。

本研究對環磷酰胺聯合白頭翁多糖的體內抗乳腺癌作用進行了初步探對，驗證了環磷酰胺的抗乳腺癌作用，亦驗證了白頭翁多糖對環磷酰胺的增效減毒作用，為降低環磷酰胺的副作用提供可行的臨床治療方案，打破其因不良反應而被限制應用的僵局。同時對于弘揚祖國傳統醫學、中藥現代化具有重要意義，并對完善天然化合物抗乳腺癌研究提供一定的理論基礎。

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