尖銳濕疣亞臨床感染HPV分型與預后的關系

姚明珠，李俊蘭，賴洪濤

(梅州市人民醫院風濕皮膚科1、皮膚科2，廣東梅州514000)

尖銳濕疣(condyloma acuminatum，CA)是因為乳頭瘤空泡病毒(human papillomavirus，HPV)A屬感染導致的外陰以及肛門周圍等出現疣狀增生性損傷，屬于性病中發病率最高的疾病[1]。經檢測人乳頭瘤空泡病毒結構主要為一種直徑為50 nm左右的環狀雙鏈無包膜DNA，大概有8 kb[2]。根據DNA結構上L1區保守序列編碼不同可以將HPV分為很多亞型，目前經證實的HPV亞型有將近100多種亞型，其中有將近40多種亞型與人生殖道感染有密切關系[3]。研究發現，不同的基因型HPV感染后對人體生殖器官受損程度不一，故患者預后往往不同[4]。本研究選取尖銳濕疣亞臨床感染患者外生殖器部位典型優體皮損進行HPV分型，觀察臨床上較為常見的尖銳濕疣亞臨床感染HPV亞型及其與患者預后相關性，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2015年4月至2016年12月在梅州市人民醫院風濕皮膚科進行初診診斷為典型CA患者158例(典型組)和CA亞臨床感染并且未經治療的患者108例(亞臨床組)。納入標準：①患者醋酸白試驗陽性，符合衛生部制定的典型尖銳濕疣及亞臨床感染型的診斷標準；②患者在確診前未經過任何私自治療；③排除生殖器以及肛周其他感染性疾病；④排除系統性疾病患者。158例典型CA患者中男性102例，女性56例；年齡18～55歲，平均(29.27±8.82)歲；病程6～62 d，平均(29.18±9.97)d。患者皮損活檢取材位置包括包皮(58例)、陰莖冠狀溝(51例)、大陰唇(29例)以及肛周(20例)。108例CA亞臨床感染患者中男性74例，女性34例；年齡18～51歲，平均(28.54±8.16)歲；病程6～58 d，平均(28.64±10.51)d。患者皮損活檢取材位置包括包皮(42例)、陰莖冠狀溝(42例)、大陰唇(16例)以及肛周(8例)。

1.2 檢測方法

1.2.1 樣本溶液制備取材范圍為典型尖銳濕疣疣體或者疣體周圍經醋酸白試驗陽性區域。在取材過程中應該避免所取的標本與尖銳濕疣亞臨床期皮損出現交叉污染情況。取材完畢后用生理鹽水將皮損處進行反復沖洗8～10次，以避免出現交叉感染。將所取得的標本置入洗脫管中進行搗碎，加入蒸餾水后進行充分漂洗，取漂洗后的混濁液上離心機以13 000 r/min進行離心10 min，棄上清后加入50 μL裂解液并進行吹打混勻，然后將混合液置入水浴箱以100℃溫度進行孕育10 min，室溫下冷卻后上離心機以13 000 r/min進行離心10 min，取上清液待用。

1.2.2 HPV基因分型檢測向PCR反應管中分別加入5 μL樣品和20 μL緩沖液，以下列條件：50℃，15 min；95℃，10 min；然后以94℃，30 s；42℃，90 s；72℃，30 s進行擴增，反復重復40次以后，在72℃下延伸5 min。然后抽取5 mL加入進離心管中，再加入pH值為7.4的SSC和0.1%SDS 5 mL混合A液5 mL，充分振蕩后置入水浴箱中，100℃下加熱10 min后置入雜交箱以51℃下進行孵育1 h，然后將膜條轉移至pH值為7.4的0.5×SSC和0.1%SDS的B液中，在雜交箱中以51℃下進行充分混勻。然后冷卻加入1：2 000的POD溶液在室溫下搖晃30 min，吸取上液后棄掉，再加入混合A液后輕輕震蕩5 min，然后棄掉上清，繼續重復此步驟一次。在加入0.4 mol檸檬酸鈉，輕輕振蕩2 min后棄掉。將膜條浸入0.1 mol檸檬酸鈉19 mL，TMB 1 mL和3%的過氧化氫10 μL混合顯色液，置于避光箱中孵育1 h。用蒸餾水對膜條進行沖洗，觀察膜條的藍色斑點位置。觀察藍色斑點位置，若出現在PC位點則認為有效，否則則認為實驗污染。最終可測得21種亞型，包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13種高危亞型和6、11、41、42、44等5種低危亞型。

1.3 研究方法患者在治療后第一個月每周進行復查一次，確定患者無復發現象則改為每兩周復查一次，期間若發現新發尖銳濕疣病灶或者行醋酸白試驗陽性亞臨床感染病灶則需要再次手術。以最后1次手術結束為起始觀察6個月，未發現新生尖銳濕疣病灶及醋酸白試驗陰性者為臨床治愈。將所測的陽性患者HPV基因分型后進行分組，擇取同一亞型為一組，了解各組的復發情況。

1.4 觀察指標分析尖銳濕疣亞臨床感染HPV-DNA類型以及感染情況，并與典型尖銳濕疣進行比較。觀察亞臨床感染不同類型HPV出現頑固性復發情況。

1.5 統計學方法應用SPSS19.0統計軟件包進行數據分析，計數資料比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 典型組和亞臨床組感染HPV-DNA類型及感染情況比較亞臨床組和典型組感染HPV-DNA亞型相比，差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表1；不同組別低危型別和高危型別比較差異也均無統計學意義(P＞0.05)，見表2。感染類型相比，典型組尖銳濕疣單一感染率明顯低于亞臨床組，三重以及三重以上感染率明顯高于亞臨床組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，而雙重感染兩組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見表3。

表1 典型組和亞臨床組感染HPV-DNA類型比較[例(%)]

表2 亞臨床組和典型組尖銳濕疣低危及高危HPV型別比較[例(%)]

表3 亞臨床組和典型組尖銳濕疣HPV感染類型比較[例(%)]

2.2 亞臨床感染不同類型HPV出現頑固性復發情況比較所檢出的108個HPV亞型中，復發次數高達3次以及3次以上的患者共14例，占13.0%，包括HPV16+18型4例、HPV16+52型3例、HPV16型3例、HPV18型2例、HPV6+11型1例、HPV43型1例。出現頑固性復發的HPV類型所占比例差異無統計學意義(χ2=3.521，P＞0.05)。

3 討論

研究發現對人類有致病作用的HPV有40余種，不同的亞型導致患者出現癥狀不一。一般來說，尖銳濕疣引起患者感染多數為亞臨床感染狀態，多發生于外陰處。而當出現典型臨床癥狀后，疣體可便發生于外陰和肛門任何地方。

在所有感染中，以HPV 6型和11型最為常見[5]。根據致癌的風險一般將其分為低危型和高危型。其中低危型主要包括HPV 6、11、40、42、43、44、55、61、81、83，其中以HPV 6、11最為常見，為尖銳濕疣的主要病原。高危型主要包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、26、53、68、82、73、53，其中以HPV16、18最為常見，其為宮頸癌發病的主要罹患因素[6]。國內同樣有研究發現，低危型是目前國內主要的感染類型[7]。臨床上治療尖銳濕疣的方法較多，雖然在治療當時效果明顯，但是不少患者仍然會出現不同程度的復發情況，甚至復發三次及三次以上的頑固性復發，原因至今不明。有研究認為HPV復發與患者體內的性激素水平具有相關性[8]。但也有研究認為，復發和患者激素水平并無相關性，可能是由于HPV感染真皮層細胞所致[9]。楊慶永等[10]則認為，尖銳濕疣復發可能與亞臨床感染具有一定的關系。

本研究擇取的亞臨床感染患者中，HPV 6型所占比例最高，為50.9%，HPV 11型和16型其次，分別占16.7%和13.0%。說明亞臨床感染主要為HPV 6型，與相關研究一致。但本研究還發現HPV 56型感染有10例，而此類型以往鮮有相關報道。究竟此類型是否與尖銳濕疣亞臨床期發生有關，目前并無相關報道，需進一步進行研究。本研究同樣發現，在HPV亞臨床感染患者中，低危型占79.6%，是主要的感染危型。并且其占比例與典型HPV感染差異無統計學意義，說明HPV感染均以低危型感染為主。本研究對頑固性復發的HPV亞型進行統計發現，HPV16和18型是最常見的復發類型，而這兩者為高危型，提示高危型是影響患者預后的因素，但如要進一步了解是否具有相關性則需要通過對更大樣本的研究。

綜上所述，尖銳濕疣亞臨床感染主要亞型為HPV 6型，并以單一感染為主，多種感染者復發率較高，應該引起臨床重視。

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