腫瘤壞死因子對喉鱗狀細胞癌細胞的增殖抑制作用

孫群，胡翔，胡福云

(深圳市寶安區石巖人民醫院耳鼻喉科1、普外科2、外一科3，廣東深圳518108)

喉鱗狀細胞癌(laryngeal squamous cellcarcinoma，LSCC)是頭頸部最常見的惡性腫瘤，也是僅次于肺癌的呼吸道癌癥[1]。LSCC好發于中老年男性，流行病學資料顯示，我國每年有3～5/10萬新發喉癌患者，其中LSCC占96%左右，發病率占全身惡性腫瘤的5.7%～7.6%，并且呈現逐年上升的趨勢[2]。手術、放療、化療仍為目前主要的治療手段，但是治療后復發、轉移、化療耐受等問題較多，術后5年生存率約為61%[3]，預后不理想，迫切需要新的治療手段。LSCC的病因和發病機制尚未完全明確，近來研究認為，其發生發展與細胞的過度增殖和凋亡的減少有關[4]，相關的分子靶向治療研究越來越廣泛。腫瘤壞死因子(TNF)有明確的抗腫瘤活性，也是體內重要的細胞因子，能夠抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡，參與腫瘤發生、發展的調節，是目前腫瘤治療常見的分子靶[5]，已用于腫瘤免疫及腫瘤臨床的研究，部分產品也已投入臨床試用。但是，TNF在LSCC中對鱗癌細胞的毒作用和機制的相關研究較少。本研究旨在探討TNF對喉鱗狀細胞癌細胞的增殖抑制作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象人喉鱗癌Hep-2細胞株，由中國科學院上海細胞生物學研究所提供。

1.2 藥品與試劑重組人腫瘤壞死因子α(TNF-α)，貨號：CYT-223，以色列ProSpec-Tany公司產品，采用RPMI-1640培養基配制20 pg/mL、50 pg/mL、100 pg/mL、200 pg/mL濃度的TNF-α溶液；RPMI-1640培養基、胎牛血清(FBS)購自美國HyClone公司；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、0.5%聚乙二醇辛基苯基醚(0.5%Txiton X-100)，購自上海紫一試劑廠；0.25%胰蛋白酶消化液，美國Gibco公司產品；細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒[碘化丙啶染色法(PI)]，碧云天生物技術研究所產品；BCA蛋白濃度測定試劑盒，北京索萊寶科技有限公司產品；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒，購自上海歌凡生物科技有限公司；兔抗人CDK4單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IgG二抗，購自上海意杰生物科技有限公司產品；增強型化學發光(ECL)底物顯色試劑盒，購自南京森貝伽生物科技有限公司；SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 儀器細胞培養板、細胞培養瓶，美國BD Falcon公司；J6HC離心機、CytoFLEX流式細胞儀及配套軟件，美國Beckman Coulter公司產品；CO2細胞培養箱，日本三洋SANYO公司產品；YB12恒溫水浴箱，英國Prima公司產品；Awareness 2100酶標儀，美國Awareness Technology公司產品；Gene genius凝膠成像儀，英國Syngene公司產品。

1.4 方法

1.4.1 細胞復蘇及培養取出保存于液氮罐中的人喉鱗癌Hep-2細胞株凍存管，迅速置于37℃水浴鍋中，恒溫水浴，使其在1 min內快速融化；采用無菌移液器將細胞懸液移入離心管內，加入3 mL RPMI-1640完全培養基[含10%滅活胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素]，輕輕吹打均勻；采用1 000 r/min速度離心8 min，棄去上清液；于沉淀物中滴加10 mL RPMI-1640完全培養基，將細胞重懸，細胞懸液轉移至50 mL細胞培養瓶內，在37℃、5%CO2相對飽和濕度的培養箱中培養；2～3 d后，加入4 mL 0.25%胰酶消化傳代；待細胞貼壁生長占滿培養瓶底面積80%時，即處于對數生長期。

1.4.2 MTT法檢測喉鱗癌Hep-2細胞增殖抑制率取對數生長期的喉鱗癌Hep-2細胞，加入RPMI-1640完全培養基制備單細胞懸液，調整濃度為5×104個/mL，將100 μL細胞懸液接種于96孔培養板，每孔滴加200 μL RPMI-1640完全培養基，在37℃、5%CO2相對飽和濕度的培養箱中培養12 h；將培養孔分為對照組、用藥組，吸去培養基，對照組加入100 μL完全培養基，用藥組分別加入100 μL濃度為20 pg/mL、50 pg/mL、100 pg/mL、200 pg/mL的TNF-α溶液，各組設6個復孔，另外設置空白組，該組不含細胞；各培養孔滴加100 μL RPMI-1640完全培養基，在37℃、5%CO2相對飽和濕度的培養箱中培養；分別培養24 h、48 h后，每孔滴加5 mg/mL MTT溶液(pH=7.4)20μL，繼續培養4 h；除去上清，每孔滴加150 μL DMSO溶液，充分混勻溶解10 min后，采用酶標儀在570 nm波長處檢測對各培養孔光密度(OD值)。計算喉鱗癌Hep-2細胞增殖抑制率(%)=[1-(用藥組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%。

1.4.3 流式細胞術(FCM)分析喉鱗癌Hep-2細胞凋亡率和細胞周期取對數生長期的喉鱗癌Hep-2細胞，加入RPMI-1640完全培養基制備單細胞懸液，調整濃度為1×105個/mL，取2 mL/孔細胞懸液接種于6孔板中，同時滴加100 μL RPMI-1640完全培養基，在37℃、5%CO2相對飽和濕度的培養箱中培養24 h，分為對照組、用藥組，吸去培養基，對照組加入100 μL完全培養基，用藥組分別加入100 μL濃度為20 pg/mL、50 pg/mL、100 pg/mL、200 pg/mL的TNF-α溶液，各組設6個復孔，培養48 h，收集各培養孔細胞，滴加0.25%胰酶4 mL消化后制備單細胞懸液，采用離心機以1 000 r/min速度離心，5 min后除去上清液，沉淀物采用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，滴加70%乙醇5 mL固定；4℃過夜后，采用離心機以1 000 r/min速度離心，5 min后除去乙醇，PBS沖洗細胞，根據細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒說明書的步驟進行操作，采用流式細胞儀分析不同時間各組喉鱗癌Hep-2細胞凋亡率及細胞周期。

1.4.4 免疫組織化學法檢測喉鱗癌Hep-2細胞中PCNA表達水平按照1.4.3中的方法培養喉鱗癌Hep-2細胞，并進行分組干預，取細胞懸液滴于細胞爬片上貼片30 min，置于RPMI-1640完全培養基內，在37℃、5%CO2相對飽和濕度的培養箱中培養3 h，PBS沖洗，依次采用4%多聚甲醛處理20 min、0.5%Txiton X-100處理20 min、3%H2O2處理15 min，按照SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒說明書進行免疫組化染色，在光鏡下對染色結果進行觀察。染色結果判定：細胞核呈棕黃色至棕褐色為染色陽性。陽性細胞率評分標準：0分：陽性細胞率＜5%；1分：5%≤陽性細胞率＜30%；2分：30%≤陽性細胞率＜70%；3分：陽性細胞率≥70%。著色程度評分標準：陰性記0分，弱陽性記1分，陽性記2分，強陽性記3分。PCNA表達水平=陽性細胞率評分+著色程度評分。

1.4.5 Western blot法檢測喉鱗癌Hep-2細胞CDK4表達水平按照1.4.3中的方法培養喉鱗癌Hep-2細胞，并進行分組干預，滴加細胞裂解液，置于冰上裂解細胞30 min，采用離心機以1 000 r/min速度離心10 min，獲得含有蛋白質的上清液，按照BCA測定試劑盒說明書步驟進行操作，檢測總蛋白濃度；配制SDS-PAGE凝膠，采用SDS-PAGE凝膠分離純化蛋白質，將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，PVDF膜置于5%脫脂奶粉中封閉90 min，PBS沖洗3次，滴加兔抗人CDK4單克隆抗體(1:1 000稀釋)、內參基因β-Actin抗體(1:500稀釋)，4℃過夜，PBS沖洗5 min×3次；滴加HRP標記二抗，室溫孵育2 h，PBS沖洗5 min×3次；按照ECL顯色試劑盒說明書進行操作，暗室內X線片顯影、定影，重復三次。采用Gene genius凝膠成像儀對電泳結果進行拍照、分析，測定CDK4表達水平。

1.5 統計學方法所有統計數據均統一整理，應用SPSS18.0軟件包分析，符合正態性的計量資料以均數±標準差(±s)表示，多組間資料比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，應用GraphPad Prism軟件繪制圖表。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組喉鱗癌Hep-2細胞增殖抑制率比較與對照組比較，各濃度TNF-α組在24 h、48 h喉鱗癌Hep-2細胞增殖抑制率明顯較高，差異有統計學意義(P＜0.05)，且喉鱗癌Hep-2細胞增殖抑制率20 pg/mL TNF-α組＜50 pg/mL TNF-α組＜100 pg/mL TNF-α組和200 pg/mL TNF-α組(P＜0.05)；與24 h比較，相同濃度TNF-α作用48 h后細胞增殖抑制率較高，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 各組喉鱗癌Hep-2細胞增殖抑制率比較±s，%)

表1 各組喉鱗癌Hep-2細胞增殖抑制率比較±s，%)

注：與對照組比較，aP＜0.05；與50 pg/mL TNF-α組比較，bP＜0.05；與20 pg/mLTNF-α組比較，cP＜0.05；與24 h比較，dP＜0.05。

組別對照組20 pg/mLTNF-α組50 pg/mLTNF-α組100 pg/mLTNF-α組200 pg/mLTNF-α組F值P值48 h 0.00±0.00 19.27±2.33abd 34.28±4.38acd 78.87±9.26abcd 79.14±9.75abcd 25.618＜0.05例數66666 24 h 0.00±0.00 15.74±2.21ab 27.64±3.18ac 58.37±5.63abc 60.46±7.47abc 19.871＜0.05

2.2 各組喉鱗癌Hep-2細胞凋亡率比較與對照組比較，各濃度TNF-α組在24 h、48 h喉鱗癌Hep-2細胞凋亡率明顯較高，差異有統計學意義(P＜0.05)，且喉鱗癌Hep-2細胞凋亡率20 pg/mL TNF-α組＜50 pg/mL TNF-α組＜100 pg/mL TNF-α組和200 pg/mL TNF-α組(P＜0.05)；與24 h比較，相同濃度TNF-α作用48 h后細胞凋亡率較高，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

2.3 各組喉鱗癌Hep-2細胞細胞周期比例比較與對照組比較，各濃度TNF-α組喉鱗癌Hep-2細胞S期細胞比例降低，G2/M期細胞比例升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，存在G2/M期細胞阻滯；且在20～100 pg/mL濃度范圍內，TNF-α濃度越高，G2/M期細胞阻滯越嚴重(P＜0.05)，見表3。

表2 各組喉鱗癌Hep-2細胞凋亡率比較±s，%)

表2 各組喉鱗癌Hep-2細胞凋亡率比較±s，%)

注：與對照組比較，aP＜0.05；與50 pg/mL TNF-α組比較，bP＜0.05；與20 pg/mLTNF-α組比較，cP＜0.05；與24 h比較，dP＜0.05。

組別對照組20 pg/mLTNF-α組50 pg/mLTNF-α組100 pg/mLTNF-α組200 pg/mLTNF-α組F值P值48 h 1.79±0.19 40.65±5.14abd 62.67±7.53acd 77.56±10.34abcd 78.15±10.17abcd 29.785＜0.05例數66666 24 h 1.74±0.21 34.27±4.23ab 53.23±6.04ac 64.57±7.74abc 65.24±7.42abc 25.693＜0.05

表3 各組喉鱗癌Hep-2細胞細胞周期比例比較(±s，%)

表3 各組喉鱗癌Hep-2細胞細胞周期比例比較(±s，%)

注：與對照組比較，aP＜0.05；與50 pg/mL TNF-α組比較，bP＜0.05；與20 pg/mLTNF-α組比較，cP＜0.05。

組別例數細胞周期對照組20 pg/mLTNF-α組50 pg/mLTNF-α組100 pg/mLTNF-α組200 pg/mLTNF-α組F值P值66666 G0/G1期68.84±3.36 67.63±4.35 66.74±4.83 62.85±3.84a 62.28±3.68ac 5.314＜0.05 S期22.58±2.85 19.53±1.56ab 16.73±1.75ac 13.66±2.18abc 13.35±1.47abc 12.864＜0.05 G2/M期7.16±0.94 11.63±1.03ab 18.64±1.47ac 25.36±2.17abc 25.75±2.05abc 17.548＜0.05

2.4 各組喉鱗癌Hep-2細胞PCNA表達水平比較與對照組比較，各濃度TNF-α組在24 h、48 h喉鱗癌Hep-2細胞PCNA表達水平明顯較低，差異有統計學意義(P＜0.05)，且喉鱗癌Hep-2細胞PCNA表達水平20 pg/mL TNF-α組＞50 pg/mL TNF-α組＞100 pg/mL TNF-α組和200 pg/mL TNF-α組(P＜0.05)；與24 h比較，相同濃度TNF-α作用48 h后細胞PCNA表達水平較低，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表4。

表4 各組喉鱗癌Hep-2細胞PCNA表達水平比較(±s，%)

表4 各組喉鱗癌Hep-2細胞PCNA表達水平比較(±s，%)

組別對照組20 pg/mLTNF-α組50 pg/mLTNF-α組100 pg/mLTNF-α組200 pg/mLTNF-α組F值P值例數66666 24 h 5.26±0.64 3.87±0.24ab 1.66±0.18ac 0.84±0.07abc 0.81±0.06abc 18.649＜0.05 48 h 5.24±0.61 3.11±0.22abd 1.05±0.13acd 0.52±0.04abcd 0.49±0.04abcd 12.564＜0.05

2.5 各組喉鱗癌Hep-2細胞CDK4活性比較與對照組比較，各濃度TNF-α組在24 h、48 h喉鱗癌Hep-2細胞CDK4活性明顯較低，差異有統計學意義(P＜0.05)，且喉鱗癌Hep-2細胞CDK4活性20 pg/mL TNF-α組＞50 pg/mL TNF-α組＞100 pg/mL TNF-α組和200 pg/mL TNF-α組(P＜0.05)；與24 h比較，相同濃度TNF-α作用48 h后細胞CDK4活性較低，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表5和圖1。

表5 各組喉鱗癌Hep-2細胞CDK4活性比較s)

表5 各組喉鱗癌Hep-2細胞CDK4活性比較s)

注：與對照組比較，aP＜0.05；與50 pg/mL TNF-α組比較，bP＜0.05；與20 pg/mLTNF-α組比較，cP＜0.05；與24 h比較，dP＜0.05。

組別對照組20 pg/mLTNF-α組50 pg/mLTNF-α組100 pg/mLTNF-α組200 pg/mLTNF-α組F值P值48 h 0.82±0.08 0.61±0.07abd 0.49±0.05acd 0.15±0.02abcd 0.14±0.02abcd 10.254＜0.05例數66666 24 h 0.83±0.09 0.72±0.08ab 0.56±0.06ac 0.21±0.03abc 0.20±0.03abc 9.687＜0.05

圖1 Western blot法檢測各組喉鱗癌Hep-2細胞CDK4活性的圖像

3 討論

LSCC是最常見的喉癌類型，臨床上以聲嘶、呼吸困難、咳嗽、吞咽異常等癥狀為主要表現，吸煙、飲酒、空氣污染、長期接觸有毒化學物質及放射線、病毒感染、性激素、微量元素缺乏等是引起該病常見的危險因素[6-7]。近年來隨著吸煙人口增多、環境污染嚴重等發病率及死亡率不斷上升，給患者造成很大痛苦，給社會也造成了沉重負擔。LSCC的治療以手術、化療、放療等為主，首次治療后易發生局部復發，還有可能對抗腫瘤藥物產生耐藥性，導致患者預后較差[8]，因此，尋找更為安全有效的治療手段尤為重要。

TNF又被稱為惡液質素，是由體內活化的巨噬細胞、NK細胞、T淋巴細胞等產生的重要細胞因子，也是首個用于腫瘤生物療法的細胞因子，已經成為醫學研究的熱點。TNF有明確的抗腫瘤活性，能夠通過誘導腫瘤細胞程序性死亡、增強宿主免疫功能、抗腫瘤新生血管形成、誘導腫瘤血管功能紊亂等機制來發揮抗腫瘤作用[9-10]。研究顯示，TNF對多種惡性腫瘤有較好的效果，能提高常規化療治療晚期非小細胞肺癌的療效[11]，還對MKN45胃癌細胞株的生長有顯著的增殖抑制作用[12]。但是，目前關于TNF在LSCC中作用的相關研究較少。本次選擇人喉鱗癌Hep-2細胞株進行培養，分為對照組和藥物組，分別采用0 pg/mL、20 pg/mL、50 pg/mL、100 pg/mL、200 pg/mL TNF-α溶液對細胞進行干預，培養24 h及48 h后，采用MTT法觀察各組細胞的增殖，FCM法檢測細胞凋亡及細胞周期比例分布。結果顯示，與對照組比較，各濃度TNF-α組Hep-2細胞增殖抑制率及凋亡率較高，且20 pg/mL TNF-α組＜50 pg/mLTNF-α組＜100 pg/mL TNF-α組和200 pg/mL TNF-α組；與24 h比較，相同濃度TNF-α作用48 h后細胞增殖抑制率及凋亡率較高(P＜0.05)，表明TNF能夠有效抑制人喉鱗癌Hep-2細胞增殖，促進細胞凋亡，且在20～100 pg/mL范圍內，藥物濃度越高，作用時間越長，對細胞增殖的抑制作用和促進細胞凋亡作用越強，具有劑量和時間依賴性。本研究中不同濃度TNF細胞增殖的抑制的相關研究既往尚不多見，這也是研究的創新之處，也提示TNF可能對喉鱗狀細胞癌的治療存在一定的臨床意義。

細胞周期調節失控能夠導致腫瘤細胞不受控制的進入細胞周期循環和快速復制，是惡性腫瘤細胞不斷分裂增殖的原因之一，干預腫瘤細胞周期，防止其進入分裂期是治療腫瘤的手段之一。G1/S期和G2/M期是細胞周期的關鍵節點[13]，將細胞阻滯于此周期可延緩細胞分裂進程，抑制腫瘤細胞增殖。本研究結果顯示，與對照組比較，各濃度TNF-α組Hep-2細胞S期細胞比例較低，G2/M期細胞比例較高；且在20～100 pg/mL濃度范圍內，TNF-α濃度越高，G2/M期細胞阻滯越嚴重(P＜0.05)，表明TNF-α能有效干預腫瘤細胞周期，將人喉鱗癌Hep-2細胞阻滯于G2/M期，減少細胞增殖，從而防治腫瘤進展。另一方面，PCNA也參與細胞增殖過程，其為DNA聚合酶δ的輔助蛋白，主要由細胞核合成，與DNA合成關系密切，可以加速DNA合成速度，啟動細胞增殖過程。另外，PCNA還能協同調控DNA修復、細胞周期控制、細胞凋亡等多個過程，是反映細胞增殖狀態的良好指標。有研究認為，PCNA在LSCC中異常表達[14]。CDK4屬于核內絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，是細胞周期調控的關鍵蛋白之一，其含量在各細胞周期中相對穩定，能夠促進細胞增殖和分裂，在LSCC中呈高表達狀態，可以推動LSCC進展，能夠用于判斷患者預后[15]。本研究結果顯示，與對照組比較，各濃度TNF-α組Hep-2細胞PCNA表達水平及CDK4活性較低；且20 pg/mL TNF-α組＞50 pg/mL TNF-α組＞100 pg/mL TNF-α組和200 pg/mL TNF-α組；與24 h比較，相同濃度TNF-α作用48 h后Hep-2細胞PCNA表達水平及CDK4活性較低(P＜0.05)，表明TNF能劑量和時間依賴性地下調PCNA表達水平及CDK4活性，從而抑制細胞增殖，促進細胞周期阻滯，起到抗腫瘤和改善預后作用。

綜上所述，TNF對喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞增殖具有抑制作用，能夠使細胞阻滯于G2期，促進細胞凋亡，其作用可能與下調PCNA表達水平和CDK酶活性有關。因此，本研究可能為喉鱗狀細胞癌的臨床治療提供了新的研究方向，有望探索出新的治療有效方法。

[1] 謝芳,董頻.喉癌預后相關因素的研究進展[J].中國中西醫結合耳鼻咽喉科雜志,2014,22(4):317-320,265.

[2] 柴麗娟.健康教育在喉癌手術患者中的應用[J].醫學信息,2014,28(13):254-255.

[3] Wiest I,Alexiou C,Mayr D,et al.Expression of the carbohydrate tumor marker Sialyl Lewis a(Ca19-9)in squamous cell carcinoma of the larynx[J].Anticancer Res,2010,30(5):1849-1853.

[4] 王洋,王斌全,高偉,等.MicroRNA-155對喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞株的作用[J].中國耳鼻咽喉頭頸外科,2013,20(6):285-289.

[5] 江海龍,王寧遠,陸一鳴.腫瘤壞死因子受體選擇性拮抗劑的研究進展[J].藥學實踐雜志,2015,33(5):392-395.

[6] Langevin SM,Mcclean MD,Michaud DS,et al.Occupational dust exposure and head and neck squamous cell carcinoma risk in a population-based case-control study conducted in the greater Boston area[J].Cancer Med,2013,2(6):978-986.

[7] 馬炳蓮,潘紹永,田甜.薄層CT掃描對喉癌的診斷及臨床價值[J].心血管病防治知識,2016,15(8):138-139.

[8] 馬巖,孫磊,于雷,等.頭頸部腫瘤靶向治療的研究進展[J].中國腫瘤生物治療雜志,2014,21(3):342-347.

[9] Thomas JA,Pope C,Wojtacha D,et al.Macrophage therapy for murine liver fibrosis recruits host effector cells improving fibrosis,regeneration,and function[J].Hepatology,2011,53(6):2003-2015.

[10] 馬杰,李銀平.腫瘤壞死因子治療惡性腫瘤的研究進展[J].中國中西醫結合急救雜志,2013,20(5):313-314.

[11] 馬杰,孫茜,李銀平.重組改構人腫瘤壞死因子聯合常規化療治療晚期非小細胞肺癌有效性和安全性的系統評價[J].中國中西醫結合急救雜志,2012,19(5):296-299.

[12] 張娜,季萬勝,楊炳乾,等.腫瘤壞死因子對不同分化程度胃癌細胞增殖及Δ133p53表達的影響[J].中國腫瘤,2015,24(4):335-339.

[13] 葉俊杰,梅自潔,李杰,等.細胞分裂周期素25A影響放射線照射后HEp-2細胞的G2/M期阻滯及凋亡[J].武漢大學學報醫學版,2013,34(2):201-204.

[14] 邱連升,王佳蓉,陳翊民,等.喉鱗癌和癌前病變中細胞凋亡及PCNA、P53、Bcl-2表達研究[J].世界最新醫學信息文摘:連續型電子期刊,2015,15(36):8-9.

[15] 曹影,王培蓓,馬熒雪,等.miR-137對人喉癌細胞株Hep-2細胞增殖的影響[J].江蘇醫藥,2013,39(9):1015-1017.