人類間充質干細胞治療阿爾茨海默病相關調控的研究進展

袁佳欣 管麗娜 王梅慧 孫忠文 任 超△ 王曉彤△

1)青島大學附屬煙臺毓璜頂醫院神經內科，山東 煙臺 264000 2)青島大學附屬煙臺毓璜頂醫院神經監護室，山東 煙臺 264000 3)煙臺芝罘醫院，山東 煙臺 264000

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是發生于老年和老年前期、以進行性認知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經系統退行性變，臨床表現為記憶障礙、失語、失用、失認、視空間能力損害、抽象思維和計算力損害、人格和行為改變等。AD是老年期最常見的癡呆類型，占老年期癡呆的60%～80%[1]。AD的發病率不斷上升，65歲以上發病率為1%～5%，85歲以上發病率為20%～40%[2]。目前AD的發病機制尚不明確，但隨著研究的深入，已取得極大的進展。AD的病因多樣復雜[3]，如β-淀粉樣蛋白(Aβ)級聯反應、Tau蛋白過度磷酸化、突觸受損、神經營養因子和神經遞質耗竭、線粒體功能紊亂、氧化應激、胰島素信號轉導途徑、血管因素、炎癥機制、鈣代謝平衡失調、軸突轉運障礙、細胞周期重返障礙、脂代謝紊亂等。其中最受肯定的是β-淀粉樣蛋白(Aβ)級聯反應，Aβ是AD腦內大量老年斑(senile plaques，SP)的主要成分，通過影響β淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)的水解從而導致腦組織內Aβ的釋放增多或清除減少，或Aβ自我積聚形成的各種寡聚體等產生神經毒性作用，且Aβ積聚還可誘導Tau蛋白的聚集[4]、突觸減少、氧化應激，使某些線粒體酶尤其細胞色素C氧化酶活性下降進而促使細胞凋亡[5]。病理學上的典型表現為大腦皮質神經細胞內神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFT，由過度磷酸化的微管Tau蛋白于神經元內高度螺旋化形成)、細胞外大量老年斑(嗜銀神經軸索突起包繞β-淀粉樣蛋白而形成)形成、大腦皮質細胞減少以及累及皮質動脈和小動脈的血管淀粉樣變性[6-7]。依據AD發病機制的多種學說也形成了多種治療策略[1-2]，如膽堿酯酶抑制劑、N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑、抗精神病藥物、抗β-淀粉樣蛋白治療(分泌酶抑制劑治療、免疫治療)、神經保護性治療(抗氧化、抗自由基、Tau蛋白去磷酸化治療及抗炎癥治療)、雌激素替代治療、抗生素治療、降膽固醇治療、鈣離子拮抗劑、抗高血壓藥物、改善腦代謝藥物、改善腦循環藥物、中藥治療及聯合用藥等，但這些僅能緩解部分癥狀，尚不能阻止疾病的進程。而AD的治療及護理需相當大的人力及花費，尋找AD的有效治療方法迫在眉睫。目前AD的治療主要集中于藥物治療，近幾年藥物治療的熱點主要集中于抗Aβ治療，而抗Aβ三期、四期臨床試驗大部分以失敗告終。干細胞的出現為本病帶來了新曙光，干細胞在基礎實驗和動物模型等方面已取得一定效果，但仍有許多問題需解決才能推廣到臨床，如人類間充質干細胞(human mesenchymal stem cells，HmeSCs)向神經細胞方向分化受多種因子調控，調控問題一直是干細胞移植治療較為核心的問題之一。本文將就HmeSCs治療AD的調控因素做一綜述，以期為將來干細胞治療AD提供參考。

1 HmeSCs成為治療AD的重要干細胞來源

神經發生在成人腦中首先記錄在海馬的腦室下區[8]和海馬的齒狀回[9-11]。神經系統的新細胞神經發生的最高水平是在胎兒和幼兒階段，但成年大腦還含有干細胞，即使在高齡時也保持發育可塑性。干細胞治療AD是近年的研究熱點，干細胞可以在特定條件下通過增殖及定向分化成不同的功能細胞。SHIHABUDDIN等[12]認為，在神經退行性疾病中干細胞最主要的來源包括多功能干細胞(來源于胚胎內細胞團)、胚胎生殖細胞(來源于胎兒的生殖腺脊)以及神經干細胞(來源于胚胎、新生兒或成人腦內)。越來越多的研究發現，異種移植后人類胚胎干細胞不僅能夠保存多能性和遷移能力，而且能夠提高老齡大鼠的認知能力，對于許多難治性疾病特別是細胞及組織缺失或損傷性疾病，干細胞研究已成為其希望[13]，但倫理問題和免疫排斥等限制其進一步的臨床應用[14]。而HmeSCs多潛能性的發現和向神經細胞定向分化的成功[15]，且其具有來源豐富、采集方便、可自體回輸及較少發生免疫排斥反應等優點[16]，為神經干細胞的來源增加了新途徑。HmeSCs能夠產生多種間充質細胞譜系，包括骨骼、軟骨、脂肪、肌腱和其他結締組織[17-19]，包括肌肉和肝細胞[20-25]。一些體內移植研究顯示HmeSCs的神經和膠質分化[26-30]，表明大腦環境產生的因子不僅可以使干細胞分化成神經元，而且可使移植的外源性間充質干細胞在腦內發現類似甚至相同的改變，這些均支持HmeSCs 可能成為干細胞治療AD的重要來源。

2 調控HmeSCs分化的相關研究

2.1 HmeSCs移植治療AD前的原始分化調控HmeSCs要想實現對AD患者的神經細胞替代治療，最關鍵是其定向分化問題需要真正解決。然而，目前僅有少數HmeSCs體外分化為神經元的報道，且表達既不一致也不持久[31-32]。 nanog是最近發現的一個基因，負責維持胚胎干細胞的多能性[33-34]，具有至少12個富含絲氨酸和蘇氨酸殘基的N末端區域[35-36]，結構上nanog含有在同源結構域部分內編碼的3個螺旋，且其中央同源結構域序列又可以分成3個區域。N端區域富含絲氨酸和蘇氨酸殘基，表明其磷酸化調節的反式激活可能通過與SMAD4的相互作用實現[36]。研究表明，nanog在胚胎干細胞、腫瘤和一些成體組織中具有活性[33-34，36-37]，胚胎干細胞在維持自我更新時會使得nanog急劇降低[33]，這已通過基因轉染技術證實[38]。自然情況下，nanog可防止干細胞分化且與Oct-4、Wnt[39]和BMP-4[40]同時起作用，通過STAT-3維持相關細胞的未分化狀態[33-34]。已有研究[41]將nanog作為提高人間充質干細胞等成體干細胞定向分化的的重要調控因子之一。同時，因nanog的調控在細胞技術工程操作層面上是較為簡單的，故其臨床應用前景令人興奮。

2.2 HmeSCs移植治療AD在患者體內的調控HmeSCs移植進入AD患者體內后一定會受到內環境相關因子的影響，其中最重要的是APP。研究發現，APP對移植干細胞的作用具有雙重性。APP在胞外結構域中經β-分泌酶的裂解，產生可溶性膜相關的羧基末端胞外域片段，且異源β-分泌酶催化該片段的膜內切割，產生Aβ和C-末端。APP基因的外顯子16和17編碼β淀粉樣蛋白(Aβ)，Aβ的積聚在AD的發病過程中起重要作用；而APP外顯子9和10編碼的APP 9～10的多肽對神經細胞生長、分化有營養和促進作用[42]。以往研究已表明，APP可能參與神經突生長、細胞增殖[43-45]、神經元遷移[46]和神經元分化[47]。有研究[41]發現，APP信號通路是參與神經干細胞分化的調控系統之一，而APP的過度表達導致這些細胞的膠質分化而不是神經分化，說明AD中的APP代謝誘導干細胞的神經膠質分化并導致干細胞群的耗盡，即使將干細胞移植到AD患者的大腦中，這些細胞也可能分化成星形膠質細胞，而不是在病理狀態下有效產生神經元。在無血清無介質條件下，干細胞以神經球的方式向上遷移并分化成神經元，表明干細胞能夠產生體外分化所必需的內源性因子。在早期無血清分化階段，許多干細胞表現出相同的萎縮形態，即細胞發生凋亡性細胞死亡。SUGAYA等[41]觀察到分化的干細胞接觸附近的凋亡細胞，表明干細胞最初在無血清分化條件下成為凋亡細胞，隨后表達遷移和(或)分化因子影響鄰近細胞的命運。凋亡細胞釋放許多因子，有研究[41]指出，凋亡細胞和APP之間有重要相關性，損傷的神經元和凋亡的神經元顯示出對APP的強免疫陽性信號。此外，該報道稱，在視黃酸介導的神經元分化過程中，APP的表達也有所增加。在視黃酸介導的人神經母細胞瘤細胞分化過程中，β淀粉樣前體蛋白(APLP-1和APLP-2)的mRNA表達也有上調。各種細胞培養系統神經元分化過程中APP表達水平的提高表明其在分化過程中的重要作用，即凋亡細胞中的APP表達升高，并影響相鄰細胞分化。分泌型APP(secreted APP，sAPP)也可以使培養的神經元產生蛋白激酶C和突觸發生[48]，除了顯著增強增殖，sAPP還能通過Ras途徑激活PC12細胞中的MAPK(ERK)。由于MAPK激活可以誘導增殖或分化，sAPP有可能在HNSCs中激活該途徑，從而誘導細胞分化。在神經干細胞的誘導下重建神經元回路的一種可能情況：從受損細胞或垂死細胞釋放的sAPP可能優先誘導干細胞向神經膠質細胞分化，而這些神經膠質細胞又可以促進其他神經干細胞向腦部病變區域遷移，隨后向神經元分化，這可能成為骨髓間充質干細胞移植治療AD時在患者體內進行調控的重要靶點。

3 問題與展望

骨髓間充質干細胞治療AD有很好的前景，但也存在問題需要解決，正如諾貝爾獎獲得者馬丁·埃文斯所說，目前干細胞研究的重點就是把實驗的成果應用于實際的臨床治療中，而干細胞分化調控就是其中較為重要的關鍵環節之一，移植前的體外調控和移植后的體內調控都很重要，更好地應用新發現的相關靶點對調控機制做進一步研究，同時避免“干細胞旅游”[49]等的出現，我們結合既往經驗[15，50-64]，贊同負責任的業內人士和專家的觀點，鼓勵大力開展基礎及應用基礎研究，科研性質的臨床應用研究在部分有條件的醫院可規范化開展。在相關研究不確切的情況下，暫不主張在臨床上大規模推廣應用。通過以上努力，希望HmeSCs治療AD的道路上越走越遠。