茵陳蒿湯聯合加味大柴胡湯對肝缺血再灌注損傷大鼠的影響

張北平 翟淑萍 苑偉 顏勇 章小兵 王百林

[摘要] 目的 觀察茵陳蒿湯聯合加味大柴胡湯對大鼠肝缺血再灌注損傷的保護作用。 方法 將肝臟缺血再灌注模型大鼠按照隨機數字表法隨機分為缺血再灌注中藥組（TCM組，n = 75）、缺血再灌注對照組（Control組，n = 75）和假手術組（Sham組，n = 75）。采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）法和Western blot法分別檢測大鼠血清中白細胞介素-1（IL-1）和肝勻漿組織中細胞間黏附分子-1（ICAM-1）及核轉錄因子-κB（NF-κB）的含量。 結果 三組大鼠缺血再灌注后，隨著時間的延長，血清IL-1含量逐漸升高，在缺血再灌注后相同時間內，TCM組血清IL-1含量均低于Control組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。隨著時間的延長，TCM組及Control組大鼠術后肝勻漿組織NF-κB及ICAM-1的表達逐漸增多，且TCM組各時間點NF-κB和ICAM-1的表達均低于對照組（P < 0.05）。結論 茵陳蒿湯聯合加味大柴胡湯可明顯減輕大鼠肝缺血再灌注的損傷，其可能是通過抑制NF-κB的激活，減少ICAM-1和IL-1的表達，從而在肝臟缺血再灌注損傷中起到保護作用。

[關鍵詞] 肝缺血再灌注；白細胞介素-1；細胞間黏附分子-1；核轉錄因子-κB

[中圖分類號] R657.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）10（c）-0015-04

[Abstract] Objective To observe the protective effect of Major Capillaries Decoction and Bubleurum Decoction on liver ischemia-reperfusion injury in rats. Methods Liver ischemia-reperfusion model rats were randomly divided into ischemia-reperfusion Chinese medicine group （TCM group， n = 75）， ischemia-reperfusion control group （control group， n = 75）， and sham operation group （sham group， n = 75）. The contents of interleukin-1 （IL-1） in serum， intercellular adhesion molecule-1 （ICAM-1） and nuclear factor-kappa B （NF-κB） in rat liver homogenate tissue were measured by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） and Western blot. Results After ischemia and reperfusion in three groups， serum IL-1 content gradually increased with the extension of time. In the same time after ischemia-reperfusion， the serum IL-1 content of TCM group was significantly lower than that of the control group， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. The expression of NF-κB and ICAM-1 in the liver homogenate tissue of TCM group and control group increased gradually with the extension of time， and the expression of TCM group was higher than that of control group at the same time point（P < 0.05）. Conclusion Major Capillaries Decoction and Bubleurum Decoction can significantly alleviate liver ischemia-reperfusion injury in rats. It may be through inhibiting the activation of NF-κB and reducing the expression of ICAM-1 and IL-1 to play a protective role in ischemia-reperfusion injury.

[Key words] Hepatic ischemia-reperfusion； Interleukin-1； Intercellular adhesion molecule-1； Nuclear factor-κB

肝缺血再灌注損傷（hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI）是一種多見于出血性休克、肝臟手術、肝臟移植術等過程中的病理生理過程，是引起肝損傷、肝衰竭及肝臟手術失敗的重要原因[1-2]。在HIRI過程中，由于Kupffer細胞和中性粒細胞的活化，產生細胞因子和趨化因子，引起組織炎癥的產生，進一步加重肝臟組織的損傷[3]。核轉錄因子-κB（NF-κB）是一種廣泛存在于細胞中具有多向性轉錄調節作用的蛋白質因子[4]，可誘導多種炎癥介質的表達[5]。細胞間黏附因子-1（ICAM-1）是一種特殊的炎癥介質，能增強炎癥細胞與血管內皮細胞的黏附，加重炎性反應[6]。

通腑泄熱法是中醫理論的一種重要方法，我們的前期實驗提示，通腑泄熱法可以通過清除氧自由基，保護肝細胞mtDNA的損傷，修復受損的肝細胞，加強利膽清熱祛濕，來保護肝細胞并修復受損肝細胞[7-9]。茵陳蒿湯聯合加味大柴胡湯是通腑泄熱法的常用方劑，本研究中利用茵陳蒿湯聯合加味大柴胡湯對大鼠肝缺血再灌注進行預處理，觀察中藥對大鼠肝臟缺血再灌注后炎癥介質白細胞介素-1（IL-1）和ICAM-1、NF-κB的影響，并分析了其保護的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康SD大鼠225只，雌雄不拘，普通飼料喂養至7周齡，200～300 g/只，SD大鼠和飼料均購自廣州中醫藥大學實驗動物中心（合格證號：44005900002510）。購入后提供充足食材和水，適應新環境1周后開始實驗。

1.1.2 儀器與試藥 中藥購自廣州市紅十字會醫院，具體中藥如下：茵陳20 g、金銀花15 g、柴胡15 g、黃芩10 g、梔子10 g、大黃10 g、延胡索10 g、白芍10 g、桂枝10 g、黃芪15 g、蒲公英10 g、豬苓10 g、澤瀉15 g、芒硝5 g，日1劑，水煎100 mL。離心機為德國艾本德離心機5810R；IL-1α酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自武漢華美公司（CSB-E04622r）；ICAM-1抗體購自Bioss公司（bs-0608R）；NF-κB抗體購自SANTA CRUZ公司（Sc-372）；GAPDH（內參）抗體購自abcam公司（Ab181602）；Western blot分析系統為杭州朗基科學儀器有限公司的LG2000數碼凝膠圖像分析系統。

1.2 方法

1.2.1 大鼠HIRI模型的建立 參照文獻[10]建立大鼠HIRI模型：術前大鼠禁食12 h，自由進水，經腹腔注射戊巴比妥（0.5 mL/100 g）麻醉，麻醉成功后，仰臥固定于操作臺上，取上腹部正中切口，充分顯露第一肝門部，用無創性微血管夾夾閉第一肝門，以阻斷肝臟的血供，阻斷后可見整個肝臟顏色逐漸變暗，呈灰暗色缺血改變，胃腸處于瘀血狀態呈暗紅色。30 min后松開血管夾，進入再灌注階段，可見肝臟、胃腸逐漸恢復鮮紅色，暗紅色變為鮮紅色說明肝臟再灌注成功，若復流不暢則終止實驗。

1.2.2 實驗分組 將SD大鼠雌雄不拘，按照隨機數字表法隨機分為缺血再灌注中藥組（TCM組，n = 75）、缺血再灌注實驗組（Control組，n = 75）和假手術組（Sham組，n = 75）。TCM組：術前按照5 mL/次中藥劑量，每日2次，予以連續灌胃3 d，術中打開腹腔后，顯露第一肝門部并阻斷，30 min后松開血管夾，進入再灌注階段；Control組：術前按照5 mL/次生理鹽水劑量，每日2次，予以連續灌胃3 d，術中打開腹腔后，顯露第一肝門部并阻斷，30 min后松開血管夾，進入再灌注階段；Sham組：術前正常飼養3 d，術中打開腹腔顯露第一肝門部后，不予阻斷肝門。

1.2.3 血液及肝臟組織標本的收集 分別于肝缺血再灌注后1、3、6 h采血和肝組織：每只大鼠每次下腔靜脈采血1 mL，然后用超速離心機（半徑9.5 cm，轉速3500 r/min）分離出血清待檢；切取適量肝臟組織（約1 cm×1 cm×1 cm）后放入-80℃低溫冰箱中保存備用。

1.2.4 血清中IL-1含量檢測 運用ELISA法檢測大鼠血清中IL-1的含量，操作按試劑盒說明書進行。

1.2.5 肝臟勻漿組織中NF-κB和ICAM-1的蛋白含量檢測 運用Western blot法檢測肝臟勻漿組織NF-κB和ICAM-1的蛋白含量，操作按說明書進行。運用數碼凝膠圖像分析系統檢測陽性表達，圖譜條帶越暗，陽性產物表達越多，計算并比較各組蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法

實驗數據采用SPSS 20.0統計軟件分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用方差齊性檢驗和方差分析，兩兩比較采用Sidak的t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠血清IL-1含量變化比較

在相同缺血再灌注時間點，TCM組血清IL-1含量均比Control組大鼠低，差異有高度統計學意義（P < 0.01）；隨著肝缺血再灌注時間的延長，三組大鼠血清IL-1的含量均逐漸升高，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。見表1。

2.2 三組大鼠術后NF-κB和ICAM-1的表達水平比較

隨著肝缺血再灌注時間的延長，TCM組和Control組大鼠肝組織勻漿中NF-κB和ICAM-1的Western blot圖譜條帶越來越暗，且Control組各個時間點NF-κB和ICAM-1的暗度均大于TCM組；Sham組大鼠肝組織勻漿中NF-κB和ICAM-1的Western blot圖譜條帶變化不明顯。見圖1。TCM組各時間點NF-κB和ICAM-1的表達水平均明顯低于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖2。

3 討論

HIRI機制目前仍不十分清楚，但其通過推動自身放大的炎性反應對肝實質造成損傷已得到公認[11]。在HIRI過程中，由于急性炎癥的產生，引起肝細胞損傷，進一步發展可導致肝細胞的凋亡[12]。NF-κB是一種轉錄因子，可調控炎性反應，在細胞受到某些炎性細胞因子、氧化應激等刺激時，可激活NF-κB，調節炎性細胞因子、細胞間黏附分子的表達及炎性反應[13]。黏附分子是細胞膜表面糖蛋白，廣泛分布于血管內皮細胞和各種白細胞表面，它通過與其受體的特異性結合，使白細胞、炎癥細胞與內皮細胞間的黏附作用增強，從而參與炎性反應、細胞的信號轉導與活化、免疫應答等生理病理過程[14]。NF-κB信號通路在黏附分子的表達中起重要作用，通過抑制NF-κB信號傳導可減少ICAM-1的表達[15]。有研究表明，在大鼠的HIRI中，缺血再灌注可顯著增加肝細胞中NF-κB的表達以及促炎細胞因子IL-1的水平，從而引起肝臟損傷[16]。本研究對大鼠的HIRI不同研究組IL-1、NF-κB和ICAM-1的含量變化進行分析，結果提示當發生HIRI時，隨著時間延長，IL-1和ICAM-1的表達增加與NF-κB的調控增強有關。

中醫中藥可以通過不同的途徑和機制減輕HIRI：茵陳蒿湯不僅可以促進膽紅素代謝，還可抑制肝細胞凋亡[17]；加味大柴胡湯能抑制氧自由基產生，起到保護肝功能作用[18]；另外，加味大柴胡湯具有明顯的抗炎、降酶、降低腫瘤壞死因子作用，也能夠通過減少自由基的產生，減輕脂質過氧化損傷和線粒體內鈣超載，從而起到減輕肝臟損傷的作用[19]。本研究通過通腑泄熱法常用的茵陳蒿湯聯合加味大柴胡湯加減，對HIRI大鼠肝組織中的NF-κB、ICAM-1和血清中IL-1含量進行研究，結果表明，中藥預處理可下調HIRI大鼠的NF-κB水平，并降低IL-1和ICAM-1的表達水平。在HIRI中，NF-κB和炎性反應密切相關，NF-κB的激活可促進促炎性細胞因子的釋放，引起肝臟損傷[20]；而抑制NF-κB途徑可以降低炎性細胞因子IL-1的表達[21]。因此，通腑泄熱法對大鼠HIRI的保護作用機制與抑制NF-κB的激活，減少ICAM-1和IL-1的表達有關，從而減輕HIRI，起到對肝臟的保護作用。

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