靈芝多糖拌種對小麥抗紋枯病的誘導效應及生長發育影響

張中霄 ，王紅艷 ，王開運，王東，姜莉莉

（1山東農業大學植物保護學院，山東泰安 271018；2山東農業大學農學院，山東泰安 271018）

0 引言

【研究意義】小麥紋枯病又稱小麥尖眼點病（sharp eyespot of wheat），是由立枯絲核菌（Rhizoctonia cerealis）侵染引起的一種世界性的土傳性真菌病害[1-2]，一般使小麥減產10%—20%，嚴重地塊減產 50%左右，個別地塊甚至絕收[3]，已成為中國小麥穩產、高產的主要障礙之一。目前國內對該病的防治主要是采用噴灑井岡霉素或者使用三唑類殺菌劑拌種。由于單一或同類殺菌劑的長期頻繁使用，小麥紋枯病菌已對多種殺菌劑產生了敏感性降低的情況，防治效果受到影響[4]。植物免疫誘抗劑能夠激活植物體內分子免疫系統，提高植物抗病性[5]，對降低農田化學農藥使用量、保障農產品質量安全具有積極作用[6-7]。【前人研究進展】研究表明，植株經誘導物誘導后，體內產生PR蛋白，其過氧化物酶（POD）、幾丁質酶、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性均大幅度增加[8]。向妙蓮等[9]研究表明，茉莉酸甲酯能提高水稻葉片中 POD、過氧化氫酶

究物的生產導表相除等系長多的導苗紋（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、PPO和 PAL活性，誘導水稻幼苗對白葉枯病的抗性。張文清等研

表明，殼寡糖、香菇多糖等多種功能糖能夠調節作生長，誘導激活植株的防御反應，增強植物對病害抵抗能力，從而誘導植株對植物病毒和真菌病害產抗性[10-11]。海帶多糖可刺激葡萄、水稻和煙草細胞生防御反應，將其施用于葡萄和煙草植株上可誘植株體內植保素的累積和一系列病程相關蛋白的達[12-14]。靈芝多糖與許多已經報道的真菌多糖結構一致，同屬于β-(1→3)-葡聚糖類[15-17]，能夠有效消生物體內的各種自由基，延緩植株衰老[18]。寧玉波[19]報道靈芝多糖能夠誘導番茄植株對灰霉病產生統抗病性，同時對番茄種子發芽和番茄植株幼苗生具有一定的促進作用。【本研究切入點】關于靈芝糖拌種防治小麥紋枯病目前尚未見報道。【擬解決關鍵問題】以小麥為研究對象，以靈芝多糖作為誘子，通過拌種的方式研究靈芝多糖對小麥發芽、幼生長和根系活力的影響。觀察靈芝多糖誘導小麥抗枯病的效果，并通過測量小麥體內保護酶的活性、丙二醛（MDA）以及葉綠素a、葉綠素b的含量來探究其誘抗機制，為靈芝多糖拌種在小麥病害防治上的推廣應用提供依據。

1 材料與方法

試驗于 2015—2016年在山東農業大學植物保護學院完成。

1.1 供試材料

小麥品種：選用對小麥紋枯病的高感品種濟麥22、中感品種山農23、中抗品種魯原502，由山東農業大學農學院提供；供試藥劑：25%靈芝多糖原粉由濟寧圣鵬化工有限公司提供；供試菌株：小麥紋枯病菌由山東農業大學農業微生物省重點實驗室保存菌種，經活化、純化后供試。

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥發芽和出苗試驗 將靈芝多糖按照4、8 g a.i./100 kg小麥種子的劑量進行拌種處理。發芽試驗：參照李山東等[20]方法略有改動，記錄并計算各處理的發芽勢和發芽率。計算公式：發芽勢（%）=（第3天各處理發芽種子粒數/供試種子粒數）×100；發育率（%）=（第6天各處理發芽種子粒數/供試種子粒數）×100。出苗試驗：參照黨志紅等[21]方法略有改動，小麥拌種后置于山東農業大學溫室中培養，于出苗后7、14、21 d記錄作物的生長狀況，統計各處理間的株高。

1.2.2 靈芝多糖拌種對小麥根系活力影響的測定

根系活力的測定采用TTC法[22]。

1.2.3 靈芝多糖拌種對小麥葉綠素含量影響的測定 參考彭運生等[23]的方法，測定不同濃度的靈芝多糖處理21 d后對小麥葉綠素a和葉綠素b含量的影響。

1.2.4 靈芝多糖盆栽防效 將靈芝多糖按照 4、8 g a.i./100 kg小麥種子的劑量拌種，以清水處理為對照（CK）。將營養一致、顆粒均勻、含水量約60%的土壤裝于塑料花盆中。每盆混入20 mL相同濃度的紋枯病菌培養液后，播種10粒處理過的種子為1個重復，每個處理重復3次。置于溫室中培養，于出苗后7、14、21 d記錄發病率和病情指數。按照公式（1）和（2）分別計算。

1.2.5 抗病相關酶的活性測定 粗酶液的制備參照劉太國等[24]方法略有改動。于靈芝多糖處理小麥種子出苗21 d后，取小麥最上端的葉片用于測定過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性。POD活性的測定參考愈創木酚法[25]；SOD活性測定采用NBT光化還原法[26]：PAL活性測定采用李合生[27]的方法。

1.2.6 靈芝多糖拌種對小麥 MDA含量影響的測定參照李合生[27]的方法，采用硫代巴比妥酸法測定MDA 的含量（μmol·g-1）。

2 結果

2.1 靈芝多糖拌種對小麥生長發育的影響

2.1.1 對小麥種子發芽的影響 靈芝多糖拌種后小麥發芽勢均高于對照，其中高感品種濟麥22和中感品種山農23與對照組差異顯著。劑量為4 g a.i./100 kg小麥種子的靈芝多糖拌種后濟麥22、山農23和魯原502的發芽勢為53.50%、52.75%、51.50%，高于對照的50.25%、50.50%、50.50%。對照完全發芽后，靈芝多糖拌種處理組與對照組的發芽率均接近 100%，無顯著性差異（表1）。

表1 靈芝多糖拌種對小麥種子發芽的影響Table 1 Effects of G. lucidum polysaccharides (GLP) seed dressing on germination of wheat

2.1.2 對小麥幼苗生長的影響 靈芝多糖種子處理對小麥生長具有促進作用，靈芝多糖處理3個品種小麥種子完全出苗后7、14 和21 d的株高均顯著高于對照。在小麥完全出苗7 d，靈芝多糖8 g a.i./100 kg種子處理組的濟麥22、山農23和魯原502株高分別為8.81、8.75和11.96 cm，顯著高于靈芝多糖4 g a.i./100 kg種子處理組的 8.03、7.50和 9.84 cm和對照組的7.35、6.28和7.01 cm，可見隨著靈芝多糖濃度的升高對小麥初期發育的促進作用更加明顯。在小麥完全出苗21 d后靈芝多糖兩個處理組的株高沒有顯著差異，但都顯著高于空白對照組（表2）。

表2 靈芝多糖拌種對小麥幼苗生長的影響Table 2 Effect of GLP seed dressing on the growth of wheat seedlings

2.1.3 對小麥根系活力的影響 靈芝多糖拌種能顯著提高小麥根系的活力。靈芝多糖8 g a.i./100 kg種子處理后21 d濟麥22、魯原502和山農23的根系活力分別為 0.26、0.33 和 0.26 mg·g-1·h-1，顯著高于4 g a.i./100 kg種子處理的根系活力（0.19、0.28、0.20 mg·g-1·h-1）以及空白對照的根系活力（0.10、0.21 和0.11 mg·g-1·h-1）（圖 1）。

2.1.4 對小麥葉片葉綠素 a和葉綠素 b含量的影響靈芝多糖拌種后小麥葉片葉綠素a和葉綠素b的含量均有所上升。靈芝多糖4 g a.i./100 kg種子處理后，濟麥22、魯原502和山農23葉綠素a的含量為1.54、1.53、1.86 mg·g-1，顯著高于空白對照 1.29、1.33和1.51 mg·g-1；葉綠素 b的含量為 0.80、0.79和 0.90 mg·g-1，顯著高于空白對照 0.67、0.67 和 0.76 mg·g-1。并且隨著靈芝多糖使用量的提高，葉綠素a和葉綠素b的含量也是有明顯上升（圖2）。

圖1 靈芝多糖拌種對小麥根系活力的影響Fig. 1 Effect of GLP on root activity of wheat

圖2 靈芝多糖拌種對小麥葉片葉綠素含量的影響Fig. 2 Effect of GLP seed dressing on the chlorophyll content of wheat leaves

2.2 靈芝多糖拌種對小麥紋枯病的誘導作用

劑量為4和8 g a.i./100 kg種子的靈芝多糖拌種處理后，對小麥紋枯病均具有一定的防治效果。其中，8 g a.i./100 kg種子劑量的靈芝多糖拌種處理，在小麥出苗 7 d后對小麥紋枯病的防治效果均在30%以上，并且持效期較長，對濟麥 22、山農 23和魯原502的21 d的防治效果分別為30.4%、26.6%和29.4%（表3）。

2.3 靈芝多糖拌種對小麥防御酶活性和 MDA含量的影響

靈芝多糖拌種后小麥葉片防御酶的活性顯著上升。4 g a.i./100 kg種子處理21 d后，濟麥22、魯原502和山農23 PAL活性分別為60.32、57.52和53.12 U·min-1·g-1FW，顯著高于空白對照的55.06、53.60和50.53 U·min-1·g-1FW。而 8 g a.i./100 kg 種子劑量靈芝多糖處理與4 g a.i./100 kg處理組并沒有顯著差異（圖3-A）。SOD、POD活性顯著上升，并且隨靈芝多糖處理濃度的升高而升高，當處理濃度為8 g a.i./100 kg時防御酶活性達到頂峰。8 g a.i./100 kg種子劑量靈芝多糖拌種后濟麥22、魯原502和山農23的POD活性分別為 135.67、137.53 和 129.73 U·min-1·g-1FW，是空白對照的1.13、1.18和1.17倍（圖3-B）；SOD活性分別為2.45、2.34和2.55 U·g-1FW，是空白對照的1.32、1.26和1.21倍（圖3-C）。

靈芝多糖拌種后，3個小麥品種葉片 MDA的含量均顯著降低。8 g a.i/100 kg靈芝多糖處理濟麥22、魯原502和山農23種子21 d后，MDA的含量為分別1.48、1.38 和 1.58 μmol·g-1，比空白對照降低 26.1%、27.1%和19.7%（圖3-D）。

圖3 靈芝多糖拌種對小麥葉片保護酶活性及丙二醛含量的影響Fig. 3 Dynamic curve of protective enzyme activities and content of MDA after GLP seed dressing in wheat

3 討論

植物免疫誘抗劑能夠提高農作物抗性和有效防控農作物病害。2002 年，ASAI等[28]報道植物本身存在有效的保護機制，可幫助植物抵抗霉菌和細菌的侵染。真菌多糖具有促進種子萌發和幼苗生長的作用，單宏英等[29]研究發現，香菇多糖可以促進煙草種子的萌發。本研究發現，靈芝多糖拌種后可增強小麥發芽勢和幼苗生長。植株葉綠素含量的高低直接反映光合作用的強弱，葉綠素含量越高葉片光合作用越強，產生的能量和積累的有機物質也就越多，抗性也隨之增強。顏惠霞等[30]研究表明，南瓜葉片中葉綠素含量與南瓜品種對白粉病的抗性呈正相關。本試驗發現靈芝多糖拌種后小麥葉片的葉綠素a和葉綠素b均顯著提高，表明靈芝多糖拌種可以在一定程度上提高小麥的光合作用，增強植物的抗病性。

表3 靈芝多糖拌種對小麥紋枯病的誘導作用Table 3 Induction effect of GLP seed dressing against sharp eyespot of wheat

國內外已有許多文獻報道了真菌多糖能調節作物生長、激活植物機體免疫、誘導植株自身產生抗病性，使植株獲得系統抗病性（systemic acquired resistance，SAR）[31-35]。本研究結果證明，用不同濃度的靈芝多糖對3個小麥品種拌種處理，均可誘導小麥對紋枯病產生抗性。靈芝多糖8 g a.i./100 kg拌種后對小麥紋枯病的防治效果在30%以上，并且持效期可達到21 d。小麥不同品種對小麥紋枯病的抗性存在差異，為降低試驗的偶然性，筆者選用對小麥紋枯病高感品種濟麥22、中感品種山農23、中抗品種魯原502進行靈芝多糖的誘導抗性試驗，然而3個不同品種經靈芝多糖拌種后對小麥紋枯病的防治效果上并沒有顯著差異，這可能是因為溫室盆栽試驗人為促使小麥發生紋枯病害，導致不同品種之間的差異性并不顯著。

王關林等[36]研究表明，植物抗逆境的能力與保護酶活性有著十分密切的關系。PAL是植物苯丙烷類代謝途徑的限速酶和關鍵酶，參與植物類黃酮、木質素和香豆酸酯類等次生代謝的形成，對植物的抗蟲、抗病、抗逆及生長發育具有重要作用[37-41]。POD活性與植物的抗病性具有正相關性，能夠延緩植物衰老[42-43]，并且SOD和POD可以協同作用清除活性氧自由基，以減輕活性氧自由基對植株的危害。本試驗表明，靈芝多糖拌種后的小麥植株體內PAL、POD和SOD活性均較對照組有所提高，這可能是在一定程度上提高小麥對紋枯病菌侵染能力的防御機制之一。MDA是膜脂過氧化作用的產物之一，其含量可反映植物對逆境條件反應的強弱和細胞膜損傷程度[44]。本試驗發現經靈芝多糖拌種后小麥植株MDA含量明顯低于空白對照處理組的含量，表明經靈芝多糖拌種后對 MDA含量有一定的抑制作用，從而可減少膜質過氧化作用對細胞的傷害，提高植株對病害的抗逆能力。由于小麥紋枯病為土傳病害并且病菌致病力強，誘導劑的效果不易發揮，靈芝多糖作為抗病誘導劑單獨使用防治小麥紋枯病效果不十分顯著。在使用化學殺菌劑防治植物病害的同時，通過配施生物誘抗劑提高植物抗病性、促進作物生長，是降低化學藥劑使用量并保證作物產量的有效途徑。李鵬鵬[45]報道，香菇多糖和新型殺菌劑氟嘧菌酰胺和適量混用，或兩者交替使用，能夠分別減少氟嘧菌酰胺用量的25%和50%，并且明顯提高對黃瓜霜霉病的防治效果；WILINGHAM 等[46]報道，嘧菌酯與氟唑活化酯（BTH）聯合施用對百香果瘡痂病的防治持效期可達25 d以上。近年來，如何減少農藥使用量降低農產品中農藥殘留成為普遍關注的問題，生物誘抗劑與化學藥劑聯合使用不僅能夠增強對植物病害的防治效果，還能減少化學農藥的使用量并延長藥劑的持效時間，將成為未來防治植物病害的研究熱點。

4 結論

靈芝多糖拌種能夠誘導小麥植株抗紋枯病，小麥經8 g a.i./100 kg種子劑量的靈芝多糖拌種后對小麥紋枯病的防治效果在30%左右。經靈芝多糖拌種后小麥葉片防御酶的活性提高，葉綠素的含量增加，丙二醛的含量降低。同時靈芝多糖拌種對小麥種子發芽和幼苗生長具有一定的促進作用。

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