林蛙油摻假分子生物學(xué)檢測(cè)方法的研究

王衛(wèi)芳，樓前，魏碧雙，顧肖巍，王婕，陳宇飛

（吉林工商學(xué)院糧食學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130507）

林蛙屬于兩棲綱林蛙屬生物，哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教授趙文閣協(xié)同東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物學(xué)院多名教授對(duì)其科學(xué)命名，把原來(lái)稱(chēng)作中國(guó)林蛙、中國(guó)林蛙長(zhǎng)白山亞種的林蛙，統(tǒng)一命名為東北林蛙。林蛙油是林蛙輸卵管的干燥物，是東北三省特有的野生珍貴特產(chǎn)，具有極高的藥用和保健價(jià)值。經(jīng)科學(xué)家鑒定主要成分為：蛋白質(zhì)、維生素a、維生素b、維生素c和18種氨基酸，鉀、鈉、鈣、鎂、鐵、鋅等13種微量元素，具有抗疲勞、抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)人體內(nèi)分泌及性功能等作用。東北林蛙所產(chǎn)的油稱(chēng)“大油”，黑龍江林蛙所產(chǎn)的油稱(chēng)“小油”。除去這兩種林蛙以外的蛙油，均稱(chēng)“偽油”，或“假油”。林蛙油摻假多樣，檢測(cè)方法也較多，本文主要闡述林蛙油摻假LAMP方法及微流控芯片技術(shù)。

1 摻假林蛙油

目前，市場(chǎng)摻假林蛙油較多，包括青蛙油、蟾蜍油、牛娃油等。東北林蛙油呈白色或黃白色，有些類(lèi)似脂肪樣，有光澤、手感滑膩、有裂紋但不規(guī)則，質(zhì)地硬脆、易碎，有特殊氣味。黑龍江林蛙油與東北林蛙油性狀相似，也是白色或黃白色，也有油脂樣光澤，有潤(rùn)滑感，但是顯微鏡下腺體細(xì)胞較小。青蛙油（黑斑蛙）是色白或黃白，也具哈蟆油一樣的油脂樣光澤。只是左右兩片形狀不對(duì)稱(chēng)，但是氣味相差較大。蟾蜍油表面淡黃色至黃棕色，沒(méi)有光澤，半透明，質(zhì)地較硬，不易碎裂，具有特異腥臭，較容易區(qū)分。

2 林蛙油摻假檢測(cè)方法

林蛙油摻假檢測(cè)以前多從來(lái)源、性狀、顯微、理化等方面的研究。這些以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)的鑒別方法簡(jiǎn)便、易行，但會(huì)受到遺傳因素、林蛙的生長(zhǎng)發(fā)育階段、自然環(huán)境的影響，同時(shí)在鑒別過(guò)程中容易受主觀(guān)因素的影響，重復(fù)性和穩(wěn)定性較差，從而影響鑒定結(jié)果的可靠性。崔巖等對(duì)中國(guó)林蛙油鑒別方法提出建議，通過(guò)遺傳、指紋圖譜方面對(duì)林蛙油的鑒定已經(jīng)有了部分研究成果。侯曉東對(duì)東北林蛙油的理化性質(zhì)進(jìn)行研究，通過(guò)紅外光譜、紫外光譜、薄層層析進(jìn)行光譜分析檢測(cè)。

3 LAMP檢測(cè)方法

LAMP技術(shù)是日本科學(xué)家Notomi于2000年發(fā)明的試驗(yàn)方法，可以在等溫條件下實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增。LAMP技術(shù)的反應(yīng)原理是，根據(jù)序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)的一對(duì)外引物，一對(duì)內(nèi)引物和一對(duì)環(huán)引物特異性識(shí)別靶序列上的六個(gè)獨(dú)立區(qū)域，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循環(huán)鏈置換反應(yīng)，60℃～65℃范圍60分鐘內(nèi)，大量合成目標(biāo)DNA，同時(shí)伴隨有副產(chǎn)物白色的焦磷酸鎂沉淀產(chǎn)生。由于LAMP擴(kuò)增過(guò)程依賴(lài)識(shí)別靶序列六個(gè)獨(dú)立區(qū)域，所以反應(yīng)特異性很強(qiáng)，并且核酸擴(kuò)增過(guò)程是在恒溫條件下進(jìn)行，檢測(cè)時(shí)間大大縮短，而且快速敏感。

在Genebank上找到林蛙、中華蟾蜍、牛蛙、青蛙的保守序列，采用在線(xiàn)LAMP引物設(shè)計(jì)軟件對(duì)每種樣品分別設(shè)計(jì)5組特異引物；進(jìn)行最佳引物篩選，選出反應(yīng)時(shí)間短、擴(kuò)增效率高的引物；將篩選出的最佳引物進(jìn)行特異性驗(yàn)證，初步建立林蛙、中華蟾蜍、牛蛙、青蛙快速檢測(cè)體系，便可分別制作出單一品種摻假檢測(cè)的試劑盒。例如：青蛙油摻假檢測(cè)試劑盒、中華蟾蜍油摻假檢測(cè)試劑盒。該試劑盒不需要安規(guī)的儀器設(shè)備，只要一臺(tái)水浴鍋，便可以進(jìn)行檢測(cè)，成本低，速度快，操作方便。

4 微流控芯片檢測(cè)

微流控芯片最初在美國(guó)被稱(chēng)為“芯片實(shí)驗(yàn)室”，在歐洲被稱(chēng)為“微整合分析芯片”，隨著材料科學(xué)、微納米加工技術(shù)和微電子學(xué)所取得的突破性進(jìn)展，微流控芯片也得到了迅速發(fā)展。微流控芯片技術(shù)是一項(xiàng)把生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)分析過(guò)程的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等基本操作單元集成到一塊微米級(jí)通道的芯片上，全過(guò)程自動(dòng)化的對(duì)微量液體或樣品進(jìn)行處理或控制的技術(shù)。它具有樣品處理時(shí)間短、檢測(cè)靈敏高、能耗和成本低等優(yōu)勢(shì)，而且可以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)設(shè)備真正意義上的便攜化。

微流控蝶式芯片是基于LAMP技術(shù)的新型分子生物學(xué)檢測(cè)手段，有24個(gè)通道，同時(shí)進(jìn)行多重檢測(cè)，一次取樣，同時(shí)實(shí)現(xiàn)林蛙油、中華蟾蜍油、牛蛙油、青蛙油的檢測(cè)。

5 結(jié)語(yǔ)

在傳統(tǒng)通過(guò)形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)、性狀以及理化檢測(cè)手段的基礎(chǔ)上，LAMP檢測(cè)方法作為新興的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)方便而快速（60min出結(jié)果），該方法必將得到廣泛的應(yīng)用。微流控芯片技術(shù)在LAMP技術(shù)的基礎(chǔ)上，將引物點(diǎn)樣于微米級(jí)通道內(nèi)，一次最多可以同時(shí)進(jìn)行24個(gè)生物化學(xué)反應(yīng)，真正實(shí)現(xiàn)了高通量的多重檢測(cè)，在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域，具有重大意義。

[1]崔巖,侯曉東,催春月,等.中國(guó)林蛙油鑒別方法研究進(jìn)展及建議[J].林蛙養(yǎng)殖,2007(10):37-39.

[2]侯曉東.東北林蛙油的理化性質(zhì)及食療研究[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù),2014(08):179-180.

[3]高丹,鄭明珠,蔡丹,等.長(zhǎng)白山林蛙油產(chǎn)品的研究現(xiàn)狀與開(kāi)發(fā)[J]農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊,2010(06):73-75.