循環(huán)腫瘤細胞檢測在乳腺癌預后評估中的作用及與乳腺癌分子分型的關(guān)系

蓋希 范鳳鳳 李占文

1869年澳大利亞Ashworth[1]首次在因癌癥死亡后的患者血液中發(fā)現(xiàn)了循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）。目前已在乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、胰腺癌、膀胱癌和腎癌等多種惡性腫瘤患者血液中發(fā)現(xiàn)CTC存在，CTC被定義為自發(fā)或因診療操作引起的、由實體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞[2]。乳腺癌已成為中國女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，占女性新發(fā)腫瘤的15%[3]。對乳腺癌發(fā)病機制、治療、療效以及預后評估的研究顯得尤為重要。CTC被稱為“液體活檢”工具，能夠?qū)崟r、動態(tài)地監(jiān)測疾病的變化，評估療效；同時由于樣本取材方便、可反復性操作、幾乎沒有創(chuàng)傷等優(yōu)點而逐漸被關(guān)注。CTC檢測已經(jīng)被美國國家食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）及中國國家食品藥品監(jiān)督管理總局（SFDA）批準，用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌（metastatic breast cancer，MBC）預后的評估[4-5]。本文就 CTC 在乳腺癌預后評估中的作用及與乳腺癌分子分型的關(guān)系作一綜述。

1CTC的檢測

大多數(shù)的實體腫瘤外周血中均可檢測到CTC，但數(shù)量稀少，幾乎是每10萬～100萬個白細胞中只有1個CTC[6]。CTC的檢測包括富集和分離兩個系統(tǒng)：一是以

CTC細胞大小、密度、陽性或者陰性免疫選擇為基礎(chǔ)的富集，二是以核酸、免疫學為基礎(chǔ)的檢測及抗原測定。常用的CTC富集方法有：免疫磁珠分離法[7]、黏附分離法、膜濾過法、梯度密度離心法、OncoQuick分離法[8]以及免疫磁珠分離和膜濾過法聯(lián)合的富集方法。常用的CTC檢測方法有：免疫細胞化學法、流式細胞術(shù)、激光掃描技術(shù)、核酸檢測技術(shù)、差減富集技術(shù)與免疫熒光染色-染色體原位雜交的整合技術(shù)（SET-iFISH）、CTC芯片、CTC-iChip[9]、AdnaTest Cancer 癌細胞檢測系統(tǒng)[10]以及上皮細胞免疫斑點法[11]。而CellSearch系統(tǒng)是將富集和檢測過程緊密結(jié)合[12]，也是唯一被FDA批準可用于臨床的CTC檢測系統(tǒng)，并相繼用于MBC、轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌和轉(zhuǎn)移性前列腺癌的臨床預后評價。但由于依賴于細胞表面表達上皮細胞黏附分子（EpCAM）的CTC才能用于CellSearch系統(tǒng)檢測，且檢測費用昂貴，大規(guī)模的臨床應(yīng)用在目前仍然難以推廣[12-13]。

2 CTC在乳腺癌中的檢測與應(yīng)用

2.1 CTC在早期乳腺癌中的檢測與應(yīng)用 Rack等[14]在化療前對2 026例早期乳腺癌患者行CTC檢測，檢出率為21.5%（435/2 026）；李蕾等[15]對26例早期乳腺癌患者行CTC檢測，檢出率為23.1%（6/26）；說明乳腺癌的侵襲和微轉(zhuǎn)移在疾病發(fā)生的早期就已經(jīng)出現(xiàn)了，乳腺癌一開始就是一種全身性疾病。Lucci等[16]首次證實CTC對非MBC的預后評估作用，通過對302例Ⅰ～Ⅲ期乳腺癌患者進行臨床研究，發(fā)現(xiàn)7.5ml外周血中檢測到CTC 的患者無瘤生存（disease free survival，DFS）和總生存（overall survival，OS）明顯降低，化療前檢測出的CTC數(shù)目與患者的復發(fā)和死亡風險呈正比。Rack等[14]研究發(fā)現(xiàn)在早期乳腺癌患者中，CTC檢出率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，淋巴結(jié)陰性者檢出率為19.7%（136/692），而陽性者檢出率為22.4%（299/1 334），兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；但CTC檢出率與腫瘤大小、組織分級及激素受體狀態(tài)無關(guān)；并得出結(jié)論患者外周血中CTC≥5個/30ml與不良預后有關(guān)，有可能作為DFS和OS的獨立預測因子。李蕾等[15]在11例輔助治療患者中發(fā)現(xiàn)有1例檢出CTC（數(shù)目為100個/7.5ml），隨訪發(fā)現(xiàn)影像學及血清腫瘤標志物均正常，穿刺病理證實右鎖骨下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。這些研究說明CTC對早期乳腺癌患者的預后有重要的預測作用，但仍需要尋找更完善的檢測方法和統(tǒng)一的檢測標準，來為臨床工作提供理論依據(jù)。

2.2 CTC在MBC中的檢測與應(yīng)用 大約40%～80%的MBC患者外周血中可檢測到CTC[15,17-18]，其中超過50%的患者CTC≥5個/7.5ml，說明MBC腫瘤負荷大，更容易檢測出CTC，因此目前的研究大多是圍繞MBC開展的，主要包括MBC的療效評估和預后預測。

2.2.1 CTC檢測對評估療效的作用 一直以來，CT、MRI和正電子發(fā)射型計算機斷層顯像（PET）等影像學檢查被認為是乳腺癌療效評估和隨訪監(jiān)測的重要方法，但是，由于對放射線損傷的顧慮和昂貴的檢查費用，使得影像學檢查的可重復性受到限制。近年來，學者們通過對CTC的研究，發(fā)現(xiàn)其在MBC療效評估上有更大的意義。李偉等[17]應(yīng)用膜濾過結(jié)合激光掃描細胞數(shù)，對136例MBC患者每3個化療周期后行CTC檢測，發(fā)現(xiàn)CTC數(shù)目的改變與病情的轉(zhuǎn)歸顯著相關(guān)（P＜0.01）；化療后CTC數(shù)目不變或下降的患者預后較好，而CTC數(shù)目增加的患者預后差。他們認為CTC檢測可用于MBC化療后療效的評價。Liu等[19]進行的一項前瞻性研究證明MBC患者CTC與影像學評估疾病進展密切相關(guān)，甚至比影像學改變更早。在化療前后連續(xù)收集外周血，動態(tài)監(jiān)測CTC數(shù)目變化，發(fā)現(xiàn)CTC數(shù)目在治療后3～4周出現(xiàn)改變，而影像學改變卻需要9～12周。MBC治療的目的是減輕腫瘤負荷，改善患者的生活質(zhì)量，延長壽命，CTC檢測對MBC療效的評估具有重要的作用，可以減少無效治療對患者身體的傷害和經(jīng)濟上的負擔，是否可以取代傳統(tǒng)的影像學檢查方法應(yīng)用于臨床，還需要更多的研究來印證。

2.2.2 CTC檢測對預后的評價 Cristofanilli等[20]應(yīng)用CellSearch系統(tǒng)檢測MBC患者外周血中的CTC，發(fā)現(xiàn)治療前CTC是無進展生存期（progression free survival，PFS）和OS的獨立預后因素。通過對177例MBC患者的研究發(fā)現(xiàn)，化療前CTC≥5個/7.5ml的患者較CTC＜5個/7.5ml的患者PFS（2.7個月比7個月）和OS（10.1個月比18個月）明顯縮短；同時，隨訪監(jiān)測也發(fā)現(xiàn)CTC≥5個/7.5ml也是患者預后差的一個因素。隨后的多項臨床研究結(jié)果均顯示CTC與MBC的預后有關(guān)，是一項獨立的預后因子[5,21-23]。而李偉等[17]的研究顯示CTC初次計數(shù)并不能預測患者疾病的最終轉(zhuǎn)歸，只有隨訪過程中CTC數(shù)目變化與患者預后明顯相關(guān)；另外，臨床病理因素與治療前后的CTC數(shù)目的變化均無明顯相關(guān)性。邊莉等[24]開展的一項多中心、前瞻性的研究結(jié)果表明，MBC患者治療前基線CTC≥5個/7.5ml與CTC＜5個/7.5ml的患者治療3～4周PFS分別為30.4和42.0周，治療6～8周PFS分別為33.4和42.0周，不同基線水平CTC患者PFS比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。雖然這兩個研究結(jié)果與Cristofanilli等[20]稍有不同，但是治療前CTC＜5個/7.5ml的MBC患者的PFS卻明顯延長，分析原因可能是由于隨訪時間過短，尚不足以反應(yīng)MBC的PFS，因此需要隨訪更長時間來驗證基線水平CTC是否可以作為判斷MBC預后的指標。遠處轉(zhuǎn)移是乳腺癌死亡的主要原因，影像學檢查方法對實體瘤的檢出有重要的意義，而對于無可測量病灶的患者影像學檢查方法的作用相對較弱。CTC檢測可以實時監(jiān)測病情，較影像學檢查能更準確、及時地判斷病情的變化。李蕾等[15]對240例MBC患者進行多因素分析顯示，CTC水平與骨轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（P＜0.05），與肺轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、腦轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及軟組織轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性（均P＞0.05）。

CTC檢測對評價MBC療效和預后具有重要的作用。在臨床工作中，通過對CTC的動態(tài)監(jiān)測，可及時準確地發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶，從而進行針對性地治療，最大限度地減輕不良反應(yīng)，提高患者的生活質(zhì)量。

3 CTC與乳腺癌分子分型的關(guān)系

2013年St.Gallen國際乳腺癌研討會共識根據(jù)基因分析或免疫組織化學結(jié)果將乳腺癌分為4種不同亞型[25]：（1）Luminal A 型：雌激素受體（ER）和孕激素受體（PR）均陽性，原癌基因人類表皮生長因子受體2（HER-2）陰性，Ki-67＜14%。（2）Luminal B 型：分為 HER-2陰性和HER-2陽性。HER-2陰性為ER陽性，HER-2陰性，同時滿足下列其中1條：Ki-67≥15%或PR陰性；HER-2陽性為ER陽性，HER-2過表達或擴增，Ki-67及PR表達水平不限。（3）HER-2過表達型。（4）基底細胞型（基底細胞表型，ER、PR和HER-2均陰性）。基底細胞型乳腺癌是指具有基底細胞基因表型并不同程度地表達基底細胞角蛋白和肌上皮標記物的乳腺癌；三陰性乳腺癌（TNBC）是ER、PR與HER-2均陰性的乳腺癌。TNBC與基底細胞型乳腺癌大約有80%的重合。分子分型的提出使人們對乳腺癌重新認識[26]，同時在治療上也有了新的突破。在傳統(tǒng)的手術(shù)、化療、放療和內(nèi)分泌治療的基礎(chǔ)上增加了靶向治療，給HER-2過表達型患者帶來明顯的臨床獲益。

外周血中的CTC起源于原發(fā)或轉(zhuǎn)移腫瘤病灶，檢測原發(fā)腫瘤的基因表型可以指導臨床治療，CTC是否也像原發(fā)腫瘤一樣表達ER、PR和HER-2？王麗娟等[27]通過對53例浸潤性乳腺癌的分子分型與CTC關(guān)系的研究，發(fā)現(xiàn)Luminal B型和TNBC患者與Luminal A型在CTC計數(shù)上有明顯差異（均P＜0.01)。李蕾等[15]發(fā)現(xiàn)HER-2陽性患者的CTC檢出率低于HER-2陰性患者（51.8%vs 79.6%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而 ER是否表達對CTC檢出率并無影響。Liu等[28]將＞30%的CTC過表達HER-2定義為CTC-HER-2陽性，CTCHER-2陽性率和陰性率分別為 48.1%（13/27）和100.0%（9/9）。McNemar’s檢驗表明 CTC 的 HER-2表達情況與腫瘤組織明顯不同（P＜0.01）。目前有多項研究報道CTC中ER、PR和HER-2的表達情況與原發(fā)腫瘤并不一致，這可能為內(nèi)分泌和靶向治療效果不佳提供了理論依據(jù)。Pogue-Geile等[29]的NSABPB-31試驗，通過建立預測模型分析應(yīng)用曲妥珠單抗的獲益情況，組織學HER-2陰性患者應(yīng)用曲妥珠單抗輔助治療后，達到良好的臨床獲益；而大約10%的組織學HER-2陽性患者應(yīng)用曲妥珠單抗輔助治療卻是無效的。Agelaki等[30]應(yīng)用靶向藥物拉帕替尼能夠有效治療CTC-HER-2陽性的MBC患者，而與原發(fā)腫瘤HER-2表達狀態(tài)無關(guān)，意味著在靶向治療過程中，監(jiān)測CTC的分子特征變化是可行的。那么，是否可以進行組織學和CTC水平的HER-2聯(lián)合檢測，對HER-2陽性者行靶向治療的同時進行療效的監(jiān)測，從而改善乳腺癌患者的生存，有待進一步深入研究。

4 展望

1889年，Paget[31]提出了“種子與土壤”學說，強調(diào)癌細胞與機體微環(huán)境之間的關(guān)系。CTC的異質(zhì)性轉(zhuǎn)錄使其表達不同的分子表型，表型之一的腫瘤干細胞卻具有自我生長、免疫逃避、合成、耐藥以及轉(zhuǎn)移的特性，而在腫瘤的起源、發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移中的作用也不同，分析CTC分子表型和基因特點比單純檢測CTC可以提供更多的臨床預后信息[32]。最新研究顯示，近40年來＜2cm的浸潤性乳腺癌或原位癌的發(fā)病率由36%增長到68%[33]，早期發(fā)現(xiàn)和及時有效的治療才是乳腺癌患者獲得DFS和OS的根本方法。因此提高乳腺癌檢測方法的靈敏度和制定統(tǒng)一的陽性值標準是亟待解決的問題。分子分型對乳腺癌的重新劃分，使TNBC成為目前治療最棘手的亞型，而其本身又是由不同亞型組成，是否可以從CTC分子特性中尋找治療TNBC的治療方法，有待進一步深入研究。個體化治療、精準醫(yī)學目標的實現(xiàn)與精確的診療密不可分，相信隨著對CTC特性的深入研究和CTC檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，CTC檢測在乳腺癌診療中將發(fā)揮更大的作用。

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