對蝦弧菌病的研究進展

呂莉，朱志東，鄧劍壕，馮豆，蔡延渠，朱宇嘉，朱盛山

（廣東藥科大學中藥開發研究所，廣東 廣州 510006）

弧菌科Vibrionaceae細菌菌體短小，直或彎曲，是近海河口微生物區系中的革蘭氏陰性菌，廣泛分布于半咸水、河口、海洋的水體和沉積物中[1]。由弧菌引起的疾病，流行面積廣，發病率高，給對蝦養殖業造成了巨大危害[2]。弧菌病（Vibriosis）的診斷和防治一直受到國內外對蝦養殖工作者的密切關注。目前，國內外已報道的弧菌主要有副溶血弧菌Vibrio prarhaemolyticus、創傷弧菌 V.vulnificus、哈維氏弧菌 V.harveyi、溶藻弧菌 V.alginolyticus、鰻弧菌 V.anguillarium和霍亂弧菌V.cholerae等[3]。本文主要綜述對蝦感染弧菌病的癥狀、不同種弧菌的鑒定和弧菌病的防治，以期為對蝦弧菌病的診斷和防治提供參考。

1 診斷

1.1 弧菌病癥狀

患弧菌病對蝦一般表現為攝食減少，活動減弱，行為異常，如在池邊淺水處不規則游動、呆滯或沉底不動等；出現不同體征，如紅腿、紅體、黃鰓、黑鰓、爛鰓、爛眼、體表甲殼有黑斑等；臨床癥狀如肌肉白濁、空腸空胃、肝胰腺不同程度的損傷、血液長時間不能凝固等。鄧歡等[4]報道感染鰻弧菌的對蝦鰓發黃，有時鰓中還出現沉積物,鰓絲變脆弱,最終鰓絲不同程度地糜爛。陳月忠等[5]報道，感染哈維氏弧菌的對蝦活力減弱，不攝食，斷須，紅腿，黃鰓，腹部肌肉漸至全身白濁，在暗光背景下局部或全身發光。陳強等[6]報道，感染溶藻弧菌的對蝦甲殼有白斑、黑斑，黑鰓，頭胸甲易剝離。張彬等[7]報道，感染創傷弧菌對蝦蝦苗肝胰腺顏色變淡，部分萎縮，空腸空胃，有些腹節肌肉略微白濁。

1.2 回歸感染試驗與弧菌鑒定

1.2.1 副溶血弧菌

1.2.1.1 回歸感染試驗

樊景鳳等[8]取紅腿病蝦肌肉組織在TCBS培養基上劃線數次分離純化出一株優勢菌，制成濃度為1.2×109cfu/mL的菌懸液，給健康凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei腹部注射0.1mL/尾。藺紅蘋等[9]取紅體病蝦肝胰腺組織勻漿液在TCBS培養基上分離純化出一株優勢菌，使養殖箱水中的含菌量達1.0×108cfu/mL，浸泡感染健康凡納濱對蝦后，癥狀與感染副溶血弧菌自然發病的癥狀相似。

1.2.1.2 弧菌鑒定

樊景鳳等[8]通過革蘭氏染色、生理生化和16S rRNA基因序列同源性分析，顯示從上述紅體病蝦中分離的病原菌株與副溶血弧菌顏色相似；不能在0%或10%NaCl胨水中生長，接觸酶試驗陽性、葡萄糖磷酸鹽胨水反應（V-P）陰性；基因序列長度為570bp，與副溶血弧菌的同源性最高，達99%，鑒定為副溶血弧菌。藺紅蘋等[9]也顯示該菌株不能在0%或10%NaCl胨水中生長，接觸酶試驗、動力試驗均陽性，V-P陰性，鑒定為副溶血弧菌。

1.2.2 哈維氏弧菌

1.2.2.1 回歸感染試驗

蘇杭[10]取黃鰓、紅腿瀕死的凡納濱對蝦的白濁色肌肉和肝胰腺劃線接種于LBN培養基上培養，分離純化得到2株優勢菌，制成濃度為3.2×105cfu/mL菌懸液，對健康凡納濱對蝦腹肌肉注射50μL/尾人工感染；黃海洪[11]取鰓絲、附肢等部位出現綠色熒光的凡納濱對蝦的肝胰腺勻漿，在TCBS平板上劃線培養分離數次純化得3株優勢菌，制成不同濃度的菌懸液注射感染，感染后凡納濱對蝦病癥與感染哈維氏弧菌自然發病的病癥相似。

1.2.2.2 弧菌鑒定

蘇杭[10]通過TCBS培養基培養、革蘭氏染色及電鏡下形態觀察、生理生化試驗和16S rRNA基因序列同源性分析，顯示從病蝦中分離的兩菌株不能在42℃或0%NaCl胨水中生長，明膠酶試驗為陽性，精氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶試驗、V-P均為陰性；同源性相似度達99%的有100個序列，其中與哈維氏弧菌菌株序列相似的有30個序列，與哈維氏弧菌聚類為一支，鑒定為哈維氏弧菌。黃海洪[11]采用類似分析顯示，上述病蝦中分離的3株病原菌均呈綠色，有熒光；賴氨酸脫羧酶試驗、吲哚產生試驗、明膠酶試驗均為陽性，精氨酸雙水解酶試驗、鳥氨酸脫羧酶試驗、色氨酸脫羧酶試驗均為陰性；與創傷弧菌的相似度最高，與哈維氏弧菌聚類為一支，鑒定為哈維氏弧菌。

1.2.3 鰻弧菌

1.2.3.1 回歸感染試驗

鄭國興等[12]用滅菌針筒作紅腿病蝦的心臟穿刺，抽取淋巴液，接種于含有2%NaCl的營養瓊脂平板上培養，分離純化獲得優勢菌，制成菌懸液肌肉注射感染健康對蝦，感染后癥狀與感染鰻弧菌自然發病蝦的癥狀相似。

1.2.3.2 弧菌鑒定

鄭國興等[12]從病蝦中分離的病原菌在TCBS培養基培養不生長；生理生化培養顯示該菌不能在42℃、0%和8%NaCl胨水中生長，精氨酸脫羧酶試驗、V-P試驗均陽性，鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶試驗和吲哚產生試驗均陰性，對弧菌抑制劑O/129敏感，鑒定為鰻弧菌。

1.2.4 霍亂弧菌

1.2.4.1 回歸感染試驗

鄭國興[13]從爛眼病蝦眼球中分離得8株純化菌，制成1 012個/mL的懸液。將健康中國對蝦Fenneropenaeus chinensis浸泡在每L海水加0.2mL懸液的水中感染；王立平等[14]取腸道腫脹病蝦幼體勻漿在海水營養瓊脂平板劃線培養，分離純化出5株菌，制成菌懸液浸泡和肌注感染健康幼蝦；曹海鵬等[15]對從患白便綜合征的凡納濱對蝦肝胰腺中分離純化得一株優勢菌，以菌餌的菌濃度為1.0×108CFU/g，每日按蝦總體重的2%投喂感染健康蝦。上述方法感染后的對蝦病癥均與感染霍亂弧菌自然發病對蝦的病癥相似。

1.2.4.2 弧菌鑒定

鄭國興[13]將從上述病蝦中分離的8株病原菌進行生化鑒定，顯示8株純化菌生物學性狀基本相同，能在42℃或0%NaCl胨水中生長，不能在5%和7%NaCl胨水中生長，賴氨酸脫羧酶陽性，精氨酸、鳥氨酸脫羧酶試驗均陰性，對弧菌抑制劑O/129敏感，鑒定為霍亂弧菌。王立平等[14]對上述病蝦中分離的5株病原菌進行鑒定，顯示基本相同的生物學性狀，也鑒定均為霍亂弧菌。曹海鵬等[15]將上述病蝦中分離的病原菌用API20E革蘭陰性菌鑒定系統進行鑒定和16S rRNA基因序列同源性分析，顯示該菌鳥氨酸試驗陽性，精氨酸、賴氨酸陰性；16S rRNA序列與GenBank數據庫中弧菌屬菌株的16S rRNA基因序列的同源性高達99%～100%，與霍亂弧菌菌株RD1的親緣性最近，鑒定為霍亂弧菌。

1.2.5 創傷弧菌

張彬等[7]取患空腸空胃病蝦苗勻漿，離心，取上清液以生理鹽水稀釋，在TCBS培養基上分離、純化得一株優勢菌。經TCBS培養基培養、革蘭氏染色、生理生化和16S rRNA基因序列同源性分析，顯示該菌株菌落呈黃色；鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶等呈陰性反應，對弧菌抑制劑O/129敏感；與創傷弧菌（JQ307112.1）的相似度最高，同源性為98.0%，鑒定為創傷弧菌。

1.2.6 溶藻弧菌

鄔長祥[16]從患病凡納濱對蝦鰓及腸勻漿中分離得到純化菌，經TCBS培養基培養、溶藻弧菌生化鑒定和16S rRNA基因序列同源性分析，菌落不能在0%NaCl胨水中生長，能在42℃和7%、10%Na-Cl胨水中生長，動力試驗為陽性；與溶藻弧菌的相似性為99%，擴增出特異性目的條帶，鑒定為溶藻弧菌。

2 抑菌試驗研究

2.1 抗生素類

張曉君等[17]采用常規瓊脂擴散（K-B）法測定了副溶血弧菌對49種常用抗生素的藥物敏感性。結果表明，副溶血弧菌對環丙沙星最敏感；對林可霉素、苯唑青霉素、新生霉素、萬古霉素、麥迪霉素、阿莫西林均耐藥。趙典惠[18]等采用紙片瓊脂擴散法測定了創傷弧菌TO-3對44種常用抗生素的藥物敏感性。結果表明，創傷弧菌TO-3對左氟沙星最敏感。姬華[19]采用微量肉湯稀釋法測定了169株創傷弧菌對12種抗菌藥的敏感性，發現左旋氧氟沙星的抑菌效果最明顯，最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）≤0.05μg/mL，阿米卡星的抑菌效果最不明顯，MIC為16μg/mL。蘇杭[10]用倍比稀釋法測定了6種抗生素對從病蝦中分離到的哈維氏弧菌的最小抑菌濃度。結果發現，鹽酸恩諾沙星最低，MIC為0.25μg/mL；甲砜霉素最高，MIC為64μg/mL。趙魯寧等[20]用ATB藥敏檢測系統檢測了31株鰻弧菌對28種抗生素的敏感性。結果顯示菌株對林可霉素、夫西地酸、甲硝唑、阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、苯唑西林和青霉素的耐藥率為100%，對紅霉素、原始霉素、泰洛星的耐藥率為94.4%，有83%以上的菌株對12種以上的抗生素具有耐藥性。

2.2 中草藥

趙典惠等[18]用紙片瓊脂擴散法測定了創傷弧菌TO-3對17味中草藥的敏感性，對五倍子和訶子最敏感；大黃最不敏感，并采用96孔板倍比稀釋法測定了五倍子、訶子和大黃對創傷弧菌TO-3的MIC和最小殺菌濃度（MBC）。結果發現，五倍子的MIC和MBC分別為0.049 mg/mL、0.098mg/mL，訶子的MIC和MBC為0.195313 mg/mL；而大黃的MIC和MBC均為1.56 mg/mL。閆茂倉等[21]用倍比稀釋法測定了22味中草藥對創傷弧菌的MIC和MBC，黃連的抑菌和殺菌效果最好，MIC和MBC均為0.49mg/mL，其次為連翹，MIC和MBC均為1.95 mg/mL。張曉君[22]用瓊脂擴散法（打孔法）測定了哈維氏弧菌對20種中草藥的藥物敏感性，蘇木最為敏感，五倍子次之；而桑葉、金銀花等的抑菌作用最不明顯；二倍稀釋法測定表明，五倍子的MIC和MBC均小于0.195 mg/mL；蘇木的MIC和MBC均為25 mg/mL；桑葉和金銀花MIC均在100 mg/mL。鄭天倫等[23]測定了15種中草藥對溶藻弧菌的MIC和MBC，石榴皮和地榆的抑菌和殺菌效果最好，MIC和MBC分別為1.56和6.25 g/L；地丁和威靈仙抑菌效果最不明顯，MIC均為100g/L。張明等[24]采用試管連續倍比稀釋法研究發現，大黃的抑菌作用最明顯，MIC和MBC分別為0.25和25 mg/mL；白頭翁、魚腥草的醇提物和五倍子、石榴皮的水提物的MIC均為3.125 mg/mL；而博落回、白頭翁、五倍子、石榴皮、黃芩的殺菌作用較其他植物提取物顯著，MBC均為6.25mg/mL。王玉娥等[25]采用倍比稀釋法測定了10種中草藥對副溶血弧菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌Vibrio fluvialis和麥氏弧菌V.metschnikovii的MIC和MBC，其中五倍子效果最佳，對副溶血、溶藻、河流、麥氏弧菌的MIC和MBC均為1.56mg/mL，對哈維氏弧菌的MIC和MBC均為3.125mg/mL；其次為黃連，對溶藻、河流、麥氏弧菌的MIC和MBC分別為3.125和6.25 mg/mL，對哈維氏、副溶血弧菌的MIC和MBC分別為6.25和12.5 mg/mL。梁利國等[26]采用試管連續稀釋法測定了五倍子等7種中草藥對副溶血、河口、霍亂弧菌和鰻弧菌的MIC和MBC，其中蘇木、五倍子、地錦草和石榴皮4種中藥具有較好的抑菌和殺菌作用，對鰻弧菌、副溶血弧菌、河口弧菌及霍亂弧菌等4種病原弧菌的MIC為0.78～6.25 mg/mL，MBC為3.12～12.5 mg/mL。周澤琴等[27]采用微量肉湯稀釋法測定了NZ中藥復方和12種水產養殖常用的抗菌中藥產品對4株弧菌（副溶血、創傷、哈維氏、溶藻弧菌）的MIC，結果NZ方與市售“蝦倍健”抑菌效果最佳，對4株弧菌的MIC在0.313～1.250g/L之間，其他市售中藥MIC均大于40.00g/L。

3 臨床試驗研究

3.1 中草藥防治

王蕓等[28]將由黃芪、大黃、甘草和黃芩等比例組成的復方中草藥按1%的劑量添加到飼料中，連續投喂凡納濱對蝦12d，停藥16d后每尾注射50μL的1×108cells/mL副溶血弧菌液，感染對蝦的7d累積死亡率（6.7%）顯著低于對照組（80%）。

3.2 微生物防治

藺紅蘋等[29]在水中加入副溶血弧菌菌液，水體含菌量達1×108個/mL，浸泡感染凡納濱對蝦，再分別加 0 pfu/mL、1×106pfu/mL、1×105pfu/mL和 1×104pfu/mL的噬菌體，死亡率分別是58%、8%、17%和33%。周鮮嬌等[30]在副溶血弧菌終濃度達2.5×107cfu/mL水中浸泡感染凡納濱對蝦1d后，一組加入副溶血弧菌噬菌體（終濃度達1.0×106pfu/mL）浸泡，另一組用每克含噬菌體1×109pfu的飼料投喂，以不加噬菌體為對照，9d的死亡率分別為6.25%、6.25%和18.75%。

3.3 免疫防治

曹劍香等[31]以每克飼料含疫苗細胞1.0×109、1.0×108、1.0×107個的溶藻弧菌疫苗飼料和不含疫苗細胞的普通飼料投喂凡納濱對蝦，30d后每組對蝦肌注1.4×107cfu/mL的溶藻弧菌0.1mL/尾，進行人工感染，15d的免疫保護率分別為66.7%、46.7%、13.3%和0。李海兵[32]分別給健康中國對蝦注射50μL鰻弧菌疫苗、鰻弧菌的牙鲆抗血清和生理鹽水，飼養一周后再分別給每組對蝦每尾注射50μL 104cfu/mL的復狀鰻弧菌進行感染。結果注射鰻弧菌疫苗、抗體和對照組對蝦的累計死亡率分別為25.82%、9.09%和46.5%。朱香萍等[33]分別給對蝦投喂含1%鰻弧菌卵黃抗體（IgY）和普通卵黃的飼料，并在第二腹節側面注射含活菌數約為108個/mL的鰻弧菌菌液30μL/尾，進行人工感染，7d內試驗組和對照組對蝦的死亡率分別為15%和60%。

4 討論

弧菌病是魚蝦養殖中最為嚴重的病害之一，嚴重限制了行業的發展[34]。防治蝦弧菌病，早期診斷至關重要。對蝦弧菌病的診斷一般靠初期癥狀來判斷和從病蝦中分離純化出優勢菌的回歸感染試驗。證實該優勢菌是病原菌后，通過TCBS培養特征、革蘭氏染色形態、生理生化和分子生物技術鑒定為何種弧菌。但是，生理生化檢測的指標不一，沒有統一標準，衡量指標還有待討論。分子生物技術已廣泛應用于水產弧菌的檢測，如PCR技術具有較強的靈敏度、準確度和特異性，對快速診斷弧菌具有重要意義。

防治對蝦弧菌病多用抗生素、中草藥、微生物和免疫方法。抗生素易殘留、耐藥，大部分被列為水產養殖禁藥；免疫防治雖展現出潛在的效果，但疫苗制備過程復雜，免疫效果受多種因素（如抗原的種類和性質、被免疫蝦的規格、投放方法以及環境因素等）的影響[35]；微生物制劑如噬菌體面臨產生抗性、安全性等問題[36]；中草藥安全無殘留、無耐藥性、天然綠色、資源豐富，對弧菌的體外抑菌效果良好，如中藥復方NZ方，對4株弧菌有效，MIC在0.313～1.250g/L，能明顯降低患弧菌病對蝦的死亡率。

中草藥抑菌試驗的結果重復性較差，MIC結果相差很大，甚至達16倍[22,25]。推測可能有以下幾個原因：一是試驗菌種型號和菌種活力，研究者選取的病原弧菌，有的分離自病蝦，有的分離自病魚或病死泥鰍Misgurnus anguillicaudatus[23,26]，菌種型號不一樣，有的研究對冰箱中保存的菌種進行菌種復蘇培養以保證菌種活力[27]；二是選取的中藥材本身的影響，中藥材因產地、氣候、采收季節不同，同一藥材成分差別很大[37]，同時選取的藥材部位[38]、炮制加工方法、貯藏運輸方法等[39,40]均會影響同一藥材成分含量，中草藥藥液的制備工藝如藥材粉碎目數、提取溶劑種類及體積、濃縮時間等均可能影響中藥材成分含量[41-43]，這些均有待探究。