水生生物環境DNA檢測技術及其應用

吳昀晟 ，唐永凱 ,2，李建林 ,2，劉凱 ,2，李紅霞 ,2，王欽 ，俞菊華 ,2

（1.南京農業大學無錫漁業學院，江蘇 無錫 214128；

2.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，江蘇 無錫 214128）

隨著我國經濟建設的快速發展，水體污染、水利工程建設、養殖業劇增等因素對水生生物的產卵場、索餌場、越冬場、洄游通道等生境帶來了許多不良的影響，導致了生物資源量急劇下降和生態環境嚴重惡化。為緩解這一現狀，目前已著手建立自然保護區、制定各項保護政策。在諸多措施實施之前，急需對水生生物資源進行全面的調查，但水生生物隱蔽性強，生長形態多變，生境復雜多樣等，難以觀測鑒定，給水生生物的保護和救治帶來了巨大的困難[1-4]。傳統的水生生物監測方法依靠觀測者對物種鑒定的形態學知識，通過肉眼觀測、人工計數進行實地調查，不但調查結果不全面，而且工作量大，調查成本高[5]。拖網、圍網、電捕魚等傳統的監測手段有時會給水生生物或水生生態系統帶來一定程度上的侵入性影響[6,7]。海底拖網會持久影響底棲生物的棲息地，甚至傷害或殺死非目標生物，降低海底結構的生物多樣性[8]。保護水生生物資源及生態系統多樣性需要掌握不同生態系統多樣性的現狀、變化規律及趨勢，亟需一種經濟、高效、準確、靈敏且不損傷目標物種的監測方法。

近年來，環境 DNA（environmental DNA，eDNA）檢測技術發展迅速，已引入水生生物資源調查領域，廣泛應用于入侵物種的早期監測、瀕危物種的分布監測、寄生蟲疾病的監測和生物量評估等。只要生物生存在水環境中就可以檢測到它的存在，評估其相對數量。因此該技術的成熟完善有望彌補傳統水生生物監測方法的不足，為水生生物資源調查提供新的視野與思路。

1 eDNA檢測技術

生存于環境中的生物與環境相互作用，不斷將含有自身遺傳信息的細胞組織釋放到環境中，例如排出尿液與糞便、分泌唾液、脫落毛發皮膚、受傷出血和尸體分解等[9-11]。eDNA是指從這些調查物種生存的環境樣本（如土壤、水、空氣等）中直接提取總DNA，其中包含活細胞組織的胞內DNA和細胞組織死亡后膜降解、細胞結構破壞而釋放到環境中的胞外DNA，是不同生物完整的基因組DNA與其降解后DNA片段的混合物[12,13]。eDNA檢測技術是指利用各種檢測手段識別eDNA中關于目標物種的信息，監測已知生物在環境中的分布情況，探尋環境中的未知生物[14]。

水生生物eDNA檢測技術主要分為：環境水樣的采集與保存、eDNA的提取與分析及結果分析三個部分。根據目標生物生理狀況、種群密度及水體環境，選取適當的采樣范圍、采樣水層、采樣次數及重復數，有助于提高目標生物的檢測率。Shaw等[15]指出，每個采樣點的重復數與檢測率有很高的相關性，重復數從2個增加到5個，檢測率明顯升高達到100%。采集的水樣應在冷藏或冷凍保存24h內抽濾或沉淀處理[16]。選擇適當的濾紙（硝酸纖維膜、混合纖維膜、玻璃纖維膜、聚碳酸酯膜等），采用合理的保存方式（乙醇或冷凍等）和有效的eDNA提取方法（酚氯仿法或各種試劑盒）以最大限度地回收水樣中的eDNA[17]，更真實地反映目標生物在環境中的存在情況。

在調查物種的目標基因選擇上，通常傾向于線粒體、葉綠體或rRNA基因中大于500bp的DNA序列，如動物線粒體中細胞色素氧化酶I基因（COI）、植物的核酮糖1,5-二磷酸羧化酶基因（rbcL）與成熟酶K基因（matK）、真菌的內轉錄間隔基因（ITS）等[18-20]。這些基因在每個細胞中的拷貝數高，特異性更靈敏。數字液滴PCR、實時熒光定量PCR等檢測技術的發展，促使eDNA檢測技術操作更加標準簡易，執行更加經濟實惠，檢測結果更加穩定可靠[21]。

2 水生生物eDNA檢測技術的應用

eDNA的應用研究最早可以追溯到1987年。Ogram等[22]通過梯度離心和層析直接從海洋底泥的沉積物中獲得了大量DNA。2000年，Rondon等[23]在土壤微生物研究中首次明確提出eDNA的概念，并迅速為廣大研究者接受。2005年，Martellini等[24]從環境中采集水樣提取DNA，尋找地表水的污染源，此技術開始應用于水生生態系統的研究。2008年，Ficetola等[25]利用特異性引物擴增水樣eDNA中的目的片段來檢測、追蹤入侵物種美國牛蛙Rana catesbeiana。eDNA技術可靠地檢測到環境中那些不能直接觀察的隱匿物種，開辟了水生生物實時監測和保護的新視野。經過多年的研究，eDNA技術檢測的水樣可以來源于沉積物[22]、冰川凍土[26]、河流[27]、池塘[25]、海洋[28]、人工水箱[29]等；水生環境中的監測生物從魚類拓展到兩棲類[29]、哺乳類[30]、爬行類[31]乃至昆蟲[32]等；監測的物種數量從單一物種到數個物種，再到同時檢測多個物種。

2.1 入侵生物的監測應用

外來生物或傳播疾病，或與本土生物競爭食物[33]，影響物種種類和數量，破壞生態系統平衡，這也是造成全球生物多樣性喪失的主要原因之一。生物入侵的早期監測是控制種群數量與入侵范圍，降低有害影響并最終消除這些生物的關鍵。但傳統監測方法不但耗時耗力、且極易低估入侵程度，而eDNA檢測技術在檢測低密度生物時仍有很高的成功率和準確度。2013年，Jerde等[34]用eDNA檢測技術監測亞洲鯉入侵密歇根湖、伊利湖等北美五大湖的情況時，發現鳙Aristichthys nobilis和鰱Hypophthalmichthys molitrix的入侵范圍已經超出了傳統監測方法劃定的監管區域，這表明eDNA檢測技術在入侵物種的精準定位方面具有傳統生物調查方法無可取代的優勢。

2.2 瀕危生物的監測應用

保護瀕危生物，首先需要了解該生物的棲息地分布，而eDNA檢測技術提供了一種簡易可靠的方法[35]。Rees等[36]比較了eDNA檢測技術與傳統的調查方法調查瀕危動物冠北螈Triturus cristatus的分布。結果表明，從發現有冠北螈的地區采集到的水樣中檢測出含有冠北螈DNA的概率為84%，且兩者的kappa系數為0.86，eDNA檢測技術與實地調查結果完全一致，這表明eDNA檢測技術檢測瀕危物種是可靠和準確的。在調查洄游性魚類的棲息地和洄游時期時，傳統的監測方法非常困難，而eDNA檢測技術則可以達到這一目標。Yamanaka等[37]利用該技術準確跟蹤調查了日本花鱸Lateolabrax japonicus、鯔 Mugil cephalus、香魚 Plecoglossus altivelis 三種季節性洄游魚類的洄游路徑，豐富了魚類的洄游模式，分析了河海之間的三座人工大壩是否影響魚類棲息地的連通性。Stewart等[38]利用eDNA檢測技術監測天鵝湖中的長江江豚Neophocaena phocaenoides asaeorientalis，發現深層水樣中的eDNA更能反映真實情況，而且在哺乳期、繁殖期等生殖活動頻的時期，被檢測到的eDNA的概率明顯增加。因此，eDNA不但反映水生生物的生物量，也可監測生物的生理活動。

2.3 寄生蟲疾病的監測應用

水生生物的保護不僅局限于資源調查和棲息地保護，還包含繁育、檢疫、疾病防治、經營管理等諸多方面。多數水生生物常患寄生蟲病，其中真核寄生蟲體型小，遺傳多樣性強，生理形態模糊，生活史復雜，宿主廣泛，難以定位并研究相關病理。Huver等[39]分析比對了eDNA技術與尸檢方法檢測吸蟲Ribeiroia ondatrae，指出eDNA檢測技術檢測寄生蟲的準確性和靈敏性很高，可以檢測到低至14 fg的DNA含量，并進一步地評估了寄生蟲的整個生命周期是否一直保持寄生狀態以及寄生蟲在適當環境下感染其他潛在宿主的可能性。Gomes等[40]研究指出，水中原生寄生蟲Chilodonella hexasticha eDNA的水平變化與隨后魚類死亡具有高度相關性，強調了eDNA檢測技術在快速評估水中寄生蟲負荷、預測寄生病爆發的潛力，為水生生物疫情的預防提供了可靠的工具。但寄生蟲囊泡和卵鞘具有很強的物理抗性[41]，需要強大的力量才能破裂釋放DNA，很可能造成錯誤的評估。

2.4 生物量評估的應用

水生生物生物量的評估一直是傳統調查的難點，特別是評估活動性強的水生動物。2012年，Thomsen等[28]首次嘗試利用eDNA檢測技術評估海洋環境中某一物種的生物量。該技術在水生生物檢測的應用從定性到相對定量，并開始向絕對定量拓展。Takahara等[42]在實驗室水箱和人工池塘里模擬野外環境，探索鯉數量和水中eDNA之間的關系，證明了eDNA濃度與鯉密度呈正相關關系，建立了線性方程。Pilliod等[43]同樣在野外試驗中證明了eDNA濃度與實測密度、生物量和占用斷面的比例呈正相關性。水環境中eDNA受多重因素的影響，Barnes等[29]發現池塘中鯉eDNA檢出濃度遵循指數衰減模式，其降解速率隨生化需氧量、葉綠素和總eDNA濃度增加而下降。Buxton等[44]比較了不同基質對水樣中eDNA的影響，結果顯示均能檢測到冠北螈的DNA，沙子、粘土、表層土三種基質與對照組的檢測率無顯著差異，10d后檢測率為40%～60%，15d后檢測率為10%～22%，22d后檢測率下降到非常低的水平。而Giguet-Covex等[45]發現在凍土沉積物中，eDNA可以保存幾百甚至幾千年。因此，為了提高eDNA評估生物量的準確性，必須闡明eDNA產生和降解的動力學機制并量化溫度、pH、葉綠素、生化需氧量、光照強度、水體、微生物群體等環境因子對eDNA的影響[46]。

3 水生生物eDNA檢測技術的優勢與挑戰

水生生物的監測與保護是一項長期性的工作，監測的成本、效率和有效性都至關重要。eDNA檢測技術通過制定標準化的應用流程可以降低工作量，縮減人工成本和調查成本。在取樣過程中，只采集棲息地的環境樣品，不與目標生物直接接觸，避免破壞本已脆弱的生境，減少對調查物種的影響，使調查無創傷性。傳統的監測方法在某些特定的季節、天氣、環境里實施非常困難，而eDNA檢測技術受自然因素影響相對較小，這不但保證了長期調查的持續性，還拓展了調查的環境范圍；同時對兩種甚至更多的目標生物調查并研究其分布，有助于分析物種之間的關系和群落多樣性的動態。Foote等[47]在探測海洋哺乳動物時，用靜態聲學監測技術識別定位鼠海豚Phocoena phocoena的同時，應用eDNA檢測技術發現了罕見的長肢領航鯨Globicephala melas。因此eDNA檢測技術是對傳統監測調查結果的印證與補充而不是取代，兩者協同開展不會互相干擾。

eDNA檢測技術在應用過程中也會遇到許多挑戰。Deiner等[48]指出，eDNA可以沿著河流漂流超過10km，也可以通過船舶或捕食者糞便出現在沒有目標生物出沒的地區，此時選擇合理的采樣地點以及持續性的監測可以有效規避此類原因所帶來的誤報。樣品在采集、運輸和保存過程中都可能發生污染。因此在調查前必須對采樣工具、設備進行嚴格的滅菌處理；每個采樣點增加陰性對照即過濾蒸餾水或無目標生物生存區域的水樣；每個采樣點的樣品隔離保存，防止交叉污染。在eDNA分析階段，容易產生假陰性或假陽性擴增的結果。PCR引物和探針特異性低，環境中的PCR抑制劑或未充分提取eDNA都會導致假陰性擴增，而引物二聚物、樣品污染則會導致假陽性擴增，因此在檢測過程中必須要增加陰性和陽性對照[42,49]。

4 水生生物eDNA檢測技術的展望

隨著第二代測序技術（Next generation sequencing，NGS）的迅速發展，Pompanon 等[50]提出了一種全新的DNA條形碼-DNA宏條形碼（DNA metabarcoding），并將其運用于水生生物監測上。通過建立物種信息庫和DNA條形碼標準數據庫，設計合理的通用引物對環境樣品中的DNA進行擴增和高通量測序，再從測序結果中得到的可操縱分類單元（operational taxonomic units，OTUs）進行多個物種的鑒定。這種高效率、低成本、快速可重復的DNA條形碼技術將更適合于復雜生態系統的水生生物鑒定及多樣性評估，對物種種群的單標記分析向整個生態系統的宏基因組分析轉移，構建動植物乃至微生物的物質能量傳遞的生態系統圖譜，從生態系統水平探索生物多樣性、生態系統穩定性和系統發育多樣性。

經過十幾年的發展，eDNA檢測技術已具備了標準化的技術流程、穩定協同的調查過程和可靠動態的調查結果等優勢，不僅可檢測常規的水生生物，還可以檢測入侵物種、瀕危物種、隱匿物種等。嘗試將eDNA檢測技術應用于水生生物的群體遺傳學中，探尋群體遺傳結構及其變化，例如應用于譜系生物地理學，從遺傳水平上揭露水生生物保護的關鍵區域，為瀕危水生生物遷地保護提供理論基礎。今后的水生生物資源調查研究中，在保護區深處或荒涼偏遠地區建立自動取樣分析站，最大程度降低人為干擾并獲取水生生物監測與環境數據，結合實時數據傳輸技術，建立一個生物多樣性監測網絡，調查水生生物多樣性的現狀、變化規律和發展趨勢。