桿狀病毒感染昆蟲(chóng)圍食膜的效應(yīng)及其干擾因子

郭 玲,蔣杰賢,楊 安,季香云,張 浩,萬(wàn)年峰?

(1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境保護(hù)研究所,上海201403;2上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海201306)

圍食膜為一層包裹著食物的非細(xì)胞長(zhǎng)管狀的薄膜結(jié)構(gòu),由昆蟲(chóng)中腸上皮細(xì)胞分泌,能抵御有毒有害物質(zhì)的侵害。據(jù)報(bào)道,圍食膜是一種功能性的抗氧化劑,保護(hù)中腸上皮細(xì)胞免受?chē)?yán)重的氧化性損傷[1-2]。桿狀病毒是鱗翅目昆蟲(chóng)的重要病原微生物,通過(guò)與昆蟲(chóng)圍食膜上的特異位點(diǎn)結(jié)合破壞圍食膜結(jié)構(gòu),進(jìn)而提高病毒對(duì)昆蟲(chóng)的致病力。桿狀病毒作用于昆蟲(chóng)圍食膜后,后者的結(jié)構(gòu)、功能與生理特征會(huì)發(fā)生變化。鑒于此,本文對(duì)圍食膜的功能、桿狀病毒對(duì)圍食膜的影響以及影響桿狀病毒感染性的干擾因子進(jìn)行簡(jiǎn)要?dú)w納,以期為桿狀病毒與昆蟲(chóng)圍食膜的互作研究提供參考。

1 圍食膜的結(jié)構(gòu)與類(lèi)型

1.1 圍食膜組成與結(jié)構(gòu)

圍食膜主要由蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)和多糖組成。圍食膜上的蛋白質(zhì)主要以糖蛋白的形式存在,能增強(qiáng)圍食膜的半滲透性和致密性,其含量在所有組分中最高(占20%—55%)。根據(jù)蛋白質(zhì)提取的難易程度,將其分為4類(lèi)：1)在高或低濃度的鹽溶液中易移除的蛋白[3];2)能夠被溫和去垢劑去除的蛋白[3];3)以非共價(jià)鍵結(jié)合,需要強(qiáng)變性劑才能將其洗脫的蛋白;4)以共價(jià)鍵的形式結(jié)合在圍食膜上的蛋白。其中,第4類(lèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好,在前3種蛋白質(zhì)的提取條件下,不能被移除[4]。

幾丁質(zhì)在圍食膜中的含量也比較高(占4%—20%)。經(jīng)幾丁質(zhì)合成酶的作用,該物質(zhì)由N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)借助β-(1,4)糖苷鍵形成[5],可分為α、β和γ 3種形式。此外,圍食膜中還含有少量的多糖。多糖往往決定圍食膜的致密性,其含量因昆蟲(chóng)種類(lèi)不同而有所差異。如甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)和華北大黑鰓金龜(Holotrichia oblita)圍食膜中糖含量分別占2.05%[6]和8.91%[7]。

電鏡觀(guān)察視野下發(fā)現(xiàn)：10根(或大于10根)同向排列的幾丁質(zhì)微纖絲耦合成微管微纖絲束,多個(gè)微管微纖絲束又進(jìn)一步耦合形成圍食膜[8-9];一般情況下,幾丁質(zhì)微纖絲以60°或90°交叉形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),但有時(shí)也以其他形式交織成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),該網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中塞滿(mǎn)著蛋白質(zhì)和糖類(lèi)[10]。

1.2 圍食膜類(lèi)型

根據(jù)合成位點(diǎn)的差異,可將圍食膜分為Ⅰ型和Ⅱ型[2]。鱗翅目和一些直翅目幼蟲(chóng)的圍食膜大多屬于Ⅰ型,該類(lèi)型的結(jié)構(gòu)為多層重疊管狀,由中腸上皮細(xì)胞經(jīng)腸腔分泌而成。Ⅱ型圍食膜多存在于雙翅目、革翅目、等翅目以及一些鱗翅目幼蟲(chóng)中,由昆蟲(chóng)的前腸和中腸連接處的特殊結(jié)構(gòu)——賁門(mén)環(huán)狀細(xì)胞分泌形成。觀(guān)察發(fā)現(xiàn),Ⅱ型圍食膜比Ⅰ型更加規(guī)則有序[11]。

昆蟲(chóng)取食不同食物后,其圍食膜形成與類(lèi)型往往也會(huì)發(fā)生變化,尤其有毒有害的液體食物(即對(duì)昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育不利)對(duì)昆蟲(chóng)圍食膜影響較為明顯。研究發(fā)現(xiàn),取食血液等無(wú)菌或者少菌液體食物的昆蟲(chóng),一般不會(huì)形成圍食膜,而攝取污染程度高的食物(如糞便、腐爛水果)的昆蟲(chóng),則會(huì)保留圍食膜[12]。此外,有些圍食膜的類(lèi)型與其發(fā)育階段有關(guān),如蚊幼蟲(chóng)期的圍食膜為Ⅱ型,而雌性成蟲(chóng)卻為Ⅰ型。有的昆蟲(chóng)圍食膜類(lèi)型與其發(fā)育階段無(wú)關(guān),如紅頭麗蠅(Calliphora erythrocephala)幼蟲(chóng)期的圍食膜類(lèi)型與成蟲(chóng)期的相同[13]。有研究表明,圍食膜的厚薄程度與昆蟲(chóng)取食的食物種類(lèi)有關(guān),并且圍食膜的厚度決定著昆蟲(chóng)防御病原物入侵的能力,如取食葉片的鱗翅目幼蟲(chóng)圍食膜比取食飼料的厚,且前者具有較低的病毒感染率和死亡率[14]。

2 圍食膜的功能

2.1 機(jī)械保護(hù)

雖然圍食膜是外界病原菌侵入的重要位點(diǎn),但同時(shí)它也具有防止微生物入侵的功能。圍食膜上存在類(lèi)凝膠功能的物質(zhì),具有潤(rùn)滑作用,該類(lèi)物質(zhì)能夠使食物順利通過(guò)中腸,避免昆蟲(chóng)因食用大顆粒物質(zhì)而引起中腸漲裂[15]。研究發(fā)現(xiàn),圍食膜的糖位點(diǎn)可與病原微生物發(fā)生吸附作用,進(jìn)而阻止病原物破壞中腸上皮細(xì)胞[16]。如家蠶(Bombyx mori)幼蟲(chóng)的圍食膜對(duì)桿狀病毒具有一定的抵御能力,在一定程度上保護(hù)了中腸上皮細(xì)胞免受病毒破壞;當(dāng)家蠶幼蟲(chóng)圍食膜被降解后,桿狀病毒對(duì)其中腸細(xì)胞破壞嚴(yán)重[17]。此外,圍食膜機(jī)械保護(hù)作用還受其他一些化學(xué)物質(zhì)影響。如剛果紅可與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合幾丁質(zhì),致使圍食膜功能發(fā)生暫時(shí)性紊亂。

2.2 化學(xué)保護(hù)

圍食膜不僅能阻止中腸細(xì)胞對(duì)金屬離子的吸收,而且能將其排出體外。如Abedi等[18]用殺蟲(chóng)劑DDT處理埃及伊蚊(Aedes aegypti)幼蟲(chóng)后,發(fā)現(xiàn)大量的圍食膜被排出體外,這可能是圍食膜與有毒物質(zhì)結(jié)合,產(chǎn)生螯合作用的結(jié)果。研究證實(shí),昆蟲(chóng)圍食膜的黏蛋白可以消除重金屬離子的危害,但某些幼蟲(chóng)對(duì)重金屬離子反應(yīng)敏感,如岡比亞按蚊(Anopheles gambiae)圍食膜受銅和鎘影響強(qiáng)烈[19]。此外,昆蟲(chóng)圍食膜對(duì)植物釋放的有毒有害物質(zhì)也具有抵御作用。

2.3 選擇透性

圍食膜是一種具有選擇透性的薄膜,其選擇透性與其孔膜結(jié)構(gòu)、食物通過(guò)圍食膜速度等有關(guān)。研究表明,鱗翅目和直翅目昆蟲(chóng)圍食膜的孔徑分別為21—29 nm和24—36 nm,食物通過(guò)圍食膜的流量分別為32—159 ng∕h和98—2 821 ng∕h[20]。圍食膜能夠從中腸上皮細(xì)胞中分離大部分的單寧酸和其他異種化感物質(zhì),但卻允許其他小分子(酚類(lèi)物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)物和消化酶)進(jìn)入。有研究發(fā)現(xiàn),幾丁質(zhì)酶能夠破壞圍食膜結(jié)構(gòu),幾丁質(zhì)酶作用時(shí)間越長(zhǎng),圍食膜損害就越大,選擇透過(guò)性也越低[21]。圍食膜的通透性與蛋白多糖的抗擊壓性能和幾丁質(zhì)纖維絲彈性有關(guān),也與中腸的位置有關(guān)[22]。據(jù)報(bào)道,低溫使圍食膜產(chǎn)生孔洞和縫隙,進(jìn)而使其通透性發(fā)生變化[9]。某些昆蟲(chóng)的圍食膜組分存在性二型現(xiàn)象,如雄性刺舌蠅(Glossina morsitans)圍食膜的通透性較雌性的高[23]。外源凝集素分子能干擾圍食膜的通透性,這些物質(zhì)與圍食膜蛋白、幾丁質(zhì)或昆蟲(chóng)中腸上皮細(xì)胞表面的糖基化位點(diǎn)結(jié)合,從而使圍食膜通透性降低。

2.4 區(qū)室化作用

位于昆蟲(chóng)中腸內(nèi)部的圍食膜,將腸腔分為內(nèi)外兩個(gè)空間——圍食膜內(nèi)空間和外空間。圍食膜相當(dāng)于一個(gè)分子篩,可使一些消化酶(如分子量較小的淀粉酶)和已被消化完全的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)透過(guò),而將一些物質(zhì)(如分子量較大的氨肽酶和羧肽酶)阻擋在外間隙內(nèi)。經(jīng)圍食膜消化產(chǎn)生的小分子物質(zhì)(如寡糖和多肽等),可與消化酶再次發(fā)生作用而進(jìn)行二次消化。據(jù)報(bào)道,腸腔的區(qū)室化加快了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在其內(nèi)外的流動(dòng),可使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)容易被消化分離,從而提高中腸吸收營(yíng)養(yǎng)的效率。在食物流向圍食膜后方的過(guò)程中,食物流的方向與圍食膜外側(cè)液的流向相反,該流動(dòng)方式可以提高消化酶利用率和食物消化率,有利于保存營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[12]。

2.5 其他功能

圍食膜還具其他兩個(gè)功能：一是抗氧化作用,如保護(hù)昆蟲(chóng)中腸上皮細(xì)胞免受氧化劑的損傷[1];二是促使繭的形成,如在結(jié)繭前,裸蛛甲(Gibbium psylloides)幼蟲(chóng)的圍食膜是解離的,結(jié)繭后,從肛門(mén)排出絲狀物[24]。

3 桿狀病毒對(duì)圍食膜的影響

3.1 改變物理結(jié)構(gòu)

圍食膜具有多孔性,允許水、鹽等小分子通過(guò),卻將一些較大的入侵物(細(xì)菌、病毒顆粒體等)拒之門(mén)外。核型多角體病毒感染斜紋夜蛾(Spodoptera litura)幼蟲(chóng)的研究表明[25],桿狀病毒能破壞昆蟲(chóng)圍食膜結(jié)構(gòu),致使圍食膜孔徑增大、膜破裂。此外,桿狀病毒與增效蛋白的聯(lián)合作用對(duì)昆蟲(chóng)圍食膜結(jié)構(gòu)的破壞更加明顯。如劉琴等[26]研究發(fā)現(xiàn),甜菜夜蛾幼蟲(chóng)經(jīng)黏蟲(chóng)顆粒體病毒(PuGv-Ps)和增效蛋白(Enhancin)共同處理后,圍食膜由原來(lái)的表面光滑逐漸表現(xiàn)為粗糙凸起,以致破損降解。蟲(chóng)媒病毒感染白紋伊蚊(Aedes albopictus)的研究表明[27-28],昆蟲(chóng)圍食膜也能抵御病毒的侵害,可以將病毒顆粒體緊緊包裹,減少病毒與中腸接觸的空間,進(jìn)而降低病毒感染的幾率。

3.2 影響化學(xué)成分

桿狀病毒感染昆蟲(chóng)后,對(duì)圍食膜結(jié)構(gòu)蛋白影響最大,如感染桿狀病毒后,黏蟲(chóng)(Mythimna separata)圍食膜蛋白丟失,進(jìn)而引起圍食膜滲透性發(fā)生變化[17]。此外,病毒增效蛋白能助推桿狀病毒對(duì)圍食膜蛋白的破壞,降解圍食膜中一種分子量較大的糖蛋白。如棉鈴蟲(chóng)顆粒體病毒(HaGV)的增效蛋白能將棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa armigera)圍食膜蛋白HaIIM86降解為70 ku和90 ku兩個(gè)多肽[22]。但Shi等[29]研究表明,蓓帶夜蛾桿狀病毒(MacoMNPV)增效蛋白對(duì)蓓帶夜蛾(Mamestra configurata)圍食膜蛋白McMUC4無(wú)影響。桿狀病毒對(duì)昆蟲(chóng)圍食膜蛋白的影響已受關(guān)注,但桿狀病毒如何調(diào)控圍食膜上的幾丁質(zhì)和多糖還有待進(jìn)一步探討。

3.3 調(diào)控蛋白基因

迄今,桿狀病毒對(duì)昆蟲(chóng)圍食膜蛋白基因的影響研究主要集中于幾丁質(zhì)蛋白基因。如Levy等[30]研究發(fā)現(xiàn),梨豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)感染核型多角體病毒(AgMNPV)后,抗AgMNPV品系的幾丁質(zhì)蛋白含量較敏感品系的高;Jakubowska等[31]報(bào)道,棉鈴蟲(chóng)感染棉鈴蟲(chóng)多角體病毒(HearNPV)后,中腸幾丁質(zhì)去乙酰基酶HaCDA5a表達(dá)量下降。蛋白基因維系著昆蟲(chóng)圍食膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,若這種穩(wěn)定性被破壞,圍食膜的結(jié)構(gòu)與功能也將會(huì)受到嚴(yán)重影響。研究顯示,家蠶(Bombyx mori)被核型多角體病毒(BmNPV)感染后,其絲氨酸蛋白酶基因的表達(dá)量在感染后早期顯著上調(diào)[32],究其原因,該基因與絲氨酸蛋白酶2(簡(jiǎn)稱(chēng)“BmSP-2”,一種具有強(qiáng)大抗BmNPV活性的蛋白基因)具有高度相似性。多糖也是圍食膜的重要組成部分,合成多糖的酶系基因如何響應(yīng)桿狀病毒的感染有待進(jìn)一步研究。

4 影響桿狀病毒對(duì)圍食膜感染性的干擾因子

4.1 病毒增效蛋白

昆蟲(chóng)病毒增效蛋白是一種富含酸性氨基酸的金屬蛋白酶,主要存在于病毒顆粒中。雖然增效蛋白含糖量不高,但具有較多與圍食膜蛋白因子結(jié)合的糖基化位點(diǎn),該位點(diǎn)使病毒粒子易穿過(guò)圍食膜,造成圍食膜降解。昆蟲(chóng)病毒增效蛋白能夠促進(jìn)病毒對(duì)昆蟲(chóng)的感染,其作用機(jī)理主要有：1)病毒增效蛋白破壞圍食膜蛋白上的糖基化位點(diǎn)和蛋白之間的二硫鍵,以及破壞幾丁質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物,進(jìn)而使圍食膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變;2)增效蛋白金屬蛋白酶能降解圍食膜的腸黏蛋白,有利于病毒粒子進(jìn)入中腸,并且避免病毒被腸液消化或排出體外;3)增效蛋白金屬蛋白酶有利于病毒核衣殼與細(xì)胞膜的吸附融合,加速病毒感染昆蟲(chóng)進(jìn)程[33]。研究發(fā)現(xiàn),病毒增效蛋白能明顯增加病毒致病力,如TnGV與增效蛋白聯(lián)合作用于粉紋夜蛾[Plusia ni(Hubner)]幼蟲(chóng)后,幼蟲(chóng)病亡率隨增效蛋白劑量的增加而增加[34]。

4.2 熒光增白劑

熒光增白劑能夠吸收紫外線(xiàn),發(fā)射415—466 nm波長(zhǎng)的熒光[35]。該物質(zhì)能增強(qiáng)病毒致病力,加快昆蟲(chóng)病亡。健康昆蟲(chóng)圍食膜表面光滑、有彈性、無(wú)孔洞縫隙,由蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)以共價(jià)鍵的形式組成。當(dāng)熒光增白劑作用于圍食膜后,其與蛋白質(zhì)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,破壞共價(jià)鍵,破解圍食膜結(jié)構(gòu),進(jìn)而便于病毒感染。熒光增白劑的作用時(shí)間和作用劑量影響圍食膜結(jié)構(gòu)[36],如甜菜夜蛾取食混有1%熒光增白劑的食物后4 h,圍食膜形態(tài)無(wú)變化,而6 h后,圍食膜彈性逐漸下降;當(dāng)甜菜夜蛾的食物源替換為0.1%熒光增白劑時(shí),其圍食膜結(jié)構(gòu)的變化較1%熒光增白劑處理的小,并且在每個(gè)處理后時(shí)間點(diǎn)都表現(xiàn)這種趨勢(shì)。

4.3 幾丁質(zhì)酶及幾丁質(zhì)合成抑制劑

幾丁質(zhì)酶是一種催化幾丁質(zhì)水解生成N-乙酰葡糖胺反應(yīng)的酶,由N-催化域、中部富含Ser∕Thr區(qū)和C-端富含Cys的幾丁質(zhì)結(jié)合域組成[37],能夠提高桿狀病毒對(duì)昆蟲(chóng)的致病力,其作用機(jī)理為：通過(guò)降解圍食膜幾丁質(zhì),致使圍食膜結(jié)構(gòu)破壞、形成孔洞縫隙,進(jìn)而使病毒顆粒體更易穿過(guò)圍食膜,侵入中腸上皮細(xì)胞,加速幼蟲(chóng)病亡。研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)幾丁質(zhì)酶處理的圍食膜,其結(jié)構(gòu)出現(xiàn)孔洞縫隙,圍食膜結(jié)構(gòu)的損壞程度隨處理后時(shí)間的延長(zhǎng)而加重,并且對(duì)圍食膜蛋白質(zhì)和糖含量也有一定影響。如黃杉毒蛾(Orgyia pseudotsugata)幼蟲(chóng)的圍食膜在灰色鏈酶菌(Streptomyces griseus)幾丁質(zhì)酶的作用下,結(jié)構(gòu)變松散,并且出現(xiàn)了孔洞和縫隙[38]。幾丁質(zhì)合成抑制劑能提高桿狀病毒對(duì)昆蟲(chóng)的致病力,這類(lèi)物質(zhì)主要包括酰基脲類(lèi)和噻嗪酮類(lèi);該類(lèi)物質(zhì)不僅能阻止幾丁質(zhì)合成,還減弱了膜蛋白O-糖苷鍵對(duì)圍食膜腸黏蛋白的保護(hù)作用[39]。通過(guò)改變幾丁質(zhì)、幾丁質(zhì)合成抑制劑與桿狀病毒對(duì)昆蟲(chóng)圍食膜的聯(lián)合作用效果,有助于研發(fā)新型殺蟲(chóng)劑[40]。

4.4 其他因子

影響桿狀病毒對(duì)圍食膜感染性的干擾因子還與昆蟲(chóng)消化道酸堿度、食性、種類(lèi)等有關(guān)。桿狀病毒幾丁質(zhì)酶基因參與降解中腸圍食膜幾丁質(zhì)[41],若昆蟲(chóng)腸道pH值過(guò)高或過(guò)低,幾丁質(zhì)酶活性均會(huì)受到抑制,進(jìn)而降低病毒對(duì)昆蟲(chóng)的致病力[42-43]。與取食卷心萵苣和人工飼料的感毒煙芽夜蛾(Heliothis virescens)幼蟲(chóng)相比,取食棉花葉片的幼蟲(chóng)對(duì)核型多角體病毒(AcMNPV)的易感性較弱[44]。昆蟲(chóng)圍食膜上的腸黏蛋白具有保護(hù)中腸上皮細(xì)胞免受外源病原物侵害的能力,其含量因昆蟲(chóng)種類(lèi)不同而不同。有研究表明,棉鈴蟲(chóng)腸黏蛋白含量較甜菜夜蛾的高,使得病毒對(duì)前者的致病力較后者弱[45-46]。

5 展望

綜上,圍食膜與桿狀病毒互作研究已成為科學(xué)家們普遍關(guān)注的焦點(diǎn)。然而,筆者認(rèn)為,該方面的理論研究還有待深入挖掘,如探討昆蟲(chóng)被桿狀病毒感染后,圍食膜功能基因、細(xì)胞凋亡caspase基因、抗菌肽gloverin基因表達(dá)量和圍食膜結(jié)構(gòu)特征的差異。此外,從應(yīng)用角度出發(fā),鑒于腸黏蛋白和幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白在昆蟲(chóng)免疫中的功能,可以研發(fā)以圍食膜蛋白等生物大分子為靶標(biāo)的新型殺蟲(chóng)劑,開(kāi)創(chuàng)一個(gè)通過(guò)控制昆蟲(chóng)中腸來(lái)解決蟲(chóng)害的新方法。

迄今,昆蟲(chóng)圍食膜與桿狀病毒的互作關(guān)系,主要是基于昆蟲(chóng)-病毒兩營(yíng)養(yǎng)級(jí)水平,若從“植物-昆蟲(chóng)-病毒”三營(yíng)養(yǎng)級(jí)關(guān)系探討它們之間的關(guān)系[47],將有助于拓寬該方面的研究?jī)?nèi)容。據(jù)報(bào)道,植物中的幾丁質(zhì)酶、植物凝集素等化學(xué)物質(zhì)會(huì)干擾昆蟲(chóng)圍食膜的結(jié)構(gòu)及其生理功能[48],為此,研究該類(lèi)化學(xué)物質(zhì)調(diào)控昆蟲(chóng)圍食膜對(duì)桿狀病毒的響應(yīng)效果,具有重要意義。最近,筆者所在團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn),取食不同寄主植物后,昆蟲(chóng)(甜菜夜蛾幼蟲(chóng))圍食膜結(jié)構(gòu)發(fā)生了一些變化,這些變化如何與桿狀病毒的感染產(chǎn)生聯(lián)系,有待進(jìn)一步探討。