飛秒激光角膜基質(zhì)透鏡用于周邊板層角膜移植的實(shí)驗(yàn)研究

高穎 張俐娜 何娜 楊詠 厲青青 程雪瑩

Terrien邊緣角膜變性與Mooren角膜潰瘍，是一類發(fā)生于周邊角膜的免疫性、非感染性疾病，病變嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致角膜穿孔，嚴(yán)重影響視功能甚至毀損眼球[1]。周邊板層或深板層角膜移植術(shù)是唯一的治療方法[1-3]。由于角膜供體材料來源匱乏，使得很多患者錯(cuò)失治療機(jī)會甚至喪失眼球。全飛秒激光小切口角膜基質(zhì)透鏡取出術(shù)（small incision lenticule extraction，SMILE）是近年來才開展的最新角膜屈光手術(shù)方式，手術(shù)中利用VisuMax飛秒激光儀精準(zhǔn)定位后，在角膜基質(zhì)層內(nèi)立體切割出一定大小和厚度的透鏡，并經(jīng)過2～4mm的周邊角膜微小切口取出，主要用于矯正近視或近視散光。通常在術(shù)中確認(rèn)完整取出基質(zhì)透鏡后即將其丟棄。由于透鏡來源于年輕健康的活體，且來源豐富，如能將該透鏡用作角膜移植術(shù)的供體組織，“變廢為寶”，將會緩解角膜供體供需矛盾。本研究將SMILE術(shù)中獲得的角膜基質(zhì)透鏡經(jīng)冰凍保存后采用兩種方法構(gòu)建周邊板層角膜移植片，對周邊角膜基質(zhì)缺損的新西蘭白兔進(jìn)行周邊板層角膜移植術(shù)的實(shí)驗(yàn)研究，觀察術(shù)后移植片的平整度，植床、移植片的組織相容性，以及移植片的存活情況。

1 材料和方法

1.1 收集和保存角膜基質(zhì)透鏡 取細(xì)胞凍存管（美國corning incorporated公司，規(guī)格 2ml），標(biāo)記左右眼，消毒后放置于手術(shù)臺，在VisuMax飛秒激光儀（德國Carl Zeiss公司）下SMILE術(shù)中取出角膜基質(zhì)透鏡，直徑為6.5mm，中央厚度為120～150μm不等，即刻將其收集在細(xì)胞凍存管中，做好標(biāo)記并登記捐贈者的姓名、病歷號及角膜基質(zhì)透鏡的邊切厚度、中央厚度和直徑，保存在-80℃深低溫冰箱中待用。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭白兔10只，雌性，2～2.5kg，實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1周。右眼為實(shí)驗(yàn)眼，分A、B兩組，均5只眼。實(shí)驗(yàn)符合美國眼科和視覺研究協(xié)會年會（ARVO）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求并通過醫(yī)院倫理委員會審查。

1.3 制作周邊角膜基質(zhì)缺損模型 用10mm環(huán)鉆在右眼鼻上方角膜壓跡，用寶石刀切除鼻上方12點(diǎn)至3點(diǎn)鐘方位，長5mm，寬3mm，厚200～300μm的周邊角膜基質(zhì)，形成周邊角膜基質(zhì)缺損模型。

1.4 構(gòu)建周邊板層角膜移植片 為方便辨認(rèn)角膜基質(zhì)透鏡組織，在制作移植片前用熒光素進(jìn)行染色。采用兩種方法構(gòu)建周邊板層移植片：A組采用單純折疊的方法，將角膜基質(zhì)透鏡沿中軸對折，并將2片角膜基質(zhì)透鏡交疊后進(jìn)行修剪。該移植片共有4層，寬和長各為3和5mm，總厚度在250～300μm左右。B組將纖維蛋白膠（護(hù)固萊士，中國上海萊士血液制品股份有限公司，2ml）涂布于折疊好的角膜基質(zhì)透鏡組織層間構(gòu)建板層角膜移植片。

1.5 周邊板層異種角膜移植術(shù) A組用10-0尼龍線直接將構(gòu)建好的板層角膜移植片縫合到右眼植床，而B組則采用纖維蛋白膠將構(gòu)建好的板層角膜移植片粘合于右眼植床，再用10-0尼龍線縫合。構(gòu)建周邊板層角膜移植片及移植方法見圖1（插頁）。

1.6 術(shù)后用藥 術(shù)后涂妥布霉素地塞米松眼膏（西班牙ALCON公司，3.5g）局部抗炎，2次/d，1.5個(gè)月后改1次/d。1.7 術(shù)后觀察 移植后2周內(nèi)，每2d觀察1次；移植后2周～1個(gè)月，每5d觀察1次；移植1個(gè)月以上，每2周觀察1次。觀察指標(biāo)包括移植片表面平整度、角膜上皮化完成和維持情況、周邊角膜形態(tài)、植床和移植片的吻合度、移植片的透明度、眼前節(jié)照片記錄。術(shù)后3周拆線，觀察期共3個(gè)月。

1.8 組織病理學(xué)檢查 觀察期末或判斷移植失敗時(shí)處死動(dòng)物，取實(shí)驗(yàn)兔眼角膜行石蠟包埋，切片，HE染色常規(guī)組織病理學(xué)檢查，觀察內(nèi)容包括移植片內(nèi)有無免疫炎癥細(xì)胞、有無角膜基質(zhì)細(xì)胞，基質(zhì)膠原的結(jié)構(gòu)等。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床轉(zhuǎn)歸經(jīng)過及結(jié)果 A組術(shù)后3～5d上皮化均完成，移植片表面平整，移植片和植床吻合度佳（圖2a、3a，見插頁）。A組在術(shù)后1～2周內(nèi)，5眼中有4眼移植片均出現(xiàn)了新生血管長入，輕、中度水腫混濁（圖2b，見插頁），而另1眼在術(shù)后10d移植片高度水腫混濁，且出現(xiàn)明確的灰白色浸潤病灶（圖3b，見插頁），予眼球摘除，行組織病理學(xué)檢查；3周左右，A組生存的4眼移植片水腫開始消退，透明度恢復(fù)，但仍有少量新生血管長入（圖2c，見插頁）；1個(gè)月之后，移植片完全透明，新生血管完全消退，并保持至觀察末期（圖2d，見插頁）。B組術(shù)后3～5d上皮化均完成，移植片表面平整，移植片和植床吻合度佳（圖4a、5a，見插頁）。術(shù)后1～2周，5眼中4眼出現(xiàn)移植片高度水腫混濁，且出現(xiàn)類似化膿樣的灰白色浸潤病灶（圖4b，見插頁），予眼球摘除，行組織病理學(xué)檢查。5眼中有1眼，其發(fā)展過程類似A組，最終移植片完全透明（圖5b-d，見插頁）。

2.2 兩組組織病理學(xué)檢查結(jié)果 A組觀察期末的組織病理學(xué)表現(xiàn)為：上皮為5～6層形態(tài)正常的鱗狀上皮細(xì)胞組成；上皮下移植片的淺層基質(zhì)內(nèi)有少許散在單核淋巴細(xì)胞，以及長梭形成纖維細(xì)胞；移植片內(nèi)透鏡層間的間隙不明顯，組織間融合良好，透鏡組織與植床貼合平整，且透鏡組織內(nèi)的角膜基質(zhì)細(xì)胞量比深層的植床內(nèi)少（這是透鏡經(jīng)過冰凍保存所致）；植床移植片交界處有少許散在單核淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞（圖6a-b，見插頁）。而發(fā)生急性排斥反應(yīng)的組織病理學(xué)表現(xiàn)如下：上皮層缺如，其下的透鏡組織膠原纖維腫脹，清晰可見4層透鏡疊加，組織內(nèi)有大量的單核淋巴細(xì)胞浸潤，及大量新生血管長入（圖7a-b，見插頁）。B組出現(xiàn)急性嚴(yán)重排斥反應(yīng)的組織病理學(xué)表現(xiàn)為：移植片表面不僅上皮缺如，還產(chǎn)生透鏡組織的壞死脫落，膠原纖維明顯腫脹，且出現(xiàn)明顯的層間間隙，組織內(nèi)有大量的單核淋巴細(xì)胞浸潤，透鏡層間及透鏡與植床間密集堆積單核淋巴細(xì)胞（圖8a-b，見插頁）。觀察期末的組織病理學(xué)表現(xiàn)為：上皮亦為形態(tài)正常的鱗狀上皮細(xì)胞組成，但稍薄，約3～4層細(xì)胞構(gòu)成；移植片內(nèi)透鏡層間的間隙也不明顯，組織間融合良好，但透鏡組織與植床出現(xiàn)明顯的間隙，植床和移植片交界處有散在單核淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，明顯較A組量多（圖9a-b，見插頁）。

3 討論

近年來，越來越多的近視者得益于SMILE術(shù)摘掉眼鏡，通常在術(shù)中完整取出后即丟棄的角膜基質(zhì)透鏡是健康的角膜組織。國際上已有文獻(xiàn)報(bào)道將冰凍保存的角膜基質(zhì)透鏡重新植入到兔眼角膜基質(zhì)內(nèi)，觀察角膜基質(zhì)透鏡自體重新植入的可行性，以及植入后的組織病理學(xué)變化與神經(jīng)再生的情況[4-6]，結(jié)果顯示組織相容性好，并具有良好的屈光效應(yīng)，可行性高。其他動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了同種異體角膜基質(zhì)透鏡移植的可行性和安全性，并且認(rèn)為該方法將來可以用于某些角膜異常以及屈光不正的治療[7-8]。也有學(xué)者將角膜基質(zhì)透鏡用于人眼，2013年，Pradhan等[9]將從一高度近視患者SMILE術(shù)中獲得的透鏡植入到另一白內(nèi)障術(shù)后的無晶體眼（高度遠(yuǎn)視）患者中，結(jié)果顯示患者術(shù)后1年無明顯手術(shù)并發(fā)癥，患者遠(yuǎn)視顯著減輕。2015年，Sun等[10]將5例SMILE術(shù)中取出的角膜基質(zhì)透鏡取出后即刻移植入患者對側(cè)的遠(yuǎn)視眼中，在為期1年的隨訪期內(nèi)無一眼發(fā)生并發(fā)癥，所有角膜透明，盡管屈光度的預(yù)測性有待進(jìn)一步提高，但研究結(jié)果提示角膜基質(zhì)透鏡用于自體遠(yuǎn)視矯正安全、有效、穩(wěn)定性好。目前已有研究將SMILE術(shù)獲得的角膜基質(zhì)透鏡用于治療角膜潰瘍及角膜穿孔的患者，最終角膜潰瘍和穿孔呈現(xiàn)瘢痕愈合，結(jié)果提示當(dāng)發(fā)生角膜穿孔等緊急情況而供體缺乏時(shí)，角膜基質(zhì)透鏡可作為一種可供選擇的治療方式[11]。此外，2016年，Yin等[12]將SMILE術(shù)獲得的角膜基質(zhì)透鏡和纖維蛋白膠用于雙層移植片的構(gòu)建，并進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)移植片上皮化良好，將該移植片用于兔的前板層角膜移植后，能夠完成上皮化并獲得良好的透明性，認(rèn)為此方法構(gòu)建的移植片可用于角膜淺層損傷的修復(fù)和治療。

筆者選取SMILE角膜基質(zhì)透鏡直徑為6.5mm，中央厚度為120～150μm不等，周邊薄、中央厚，以該角膜基質(zhì)透鏡為供體組織行周邊板層角膜移植的手術(shù)方法跟傳統(tǒng)的手術(shù)方法不同，需要解決的關(guān)鍵點(diǎn)是如何將角膜基質(zhì)透鏡制作成適合周邊板層角膜移植術(shù)、形狀匹配的角膜移植片。因此，筆者先用熒光素染色角膜基質(zhì)透鏡以利于辨認(rèn)角膜基質(zhì)透鏡的中軸線和邊緣，并采用兩種方法構(gòu)建板層移植片：A組采用單純折疊的方法，將基質(zhì)角膜基質(zhì)透鏡沿中軸對折，并將2片角膜基質(zhì)透鏡交疊后進(jìn)行修剪，該移植片共有4層，寬和長各為3和5mm，總厚度在250～300μm。而B組將涂布于折疊好的透鏡組織層間構(gòu)建板層角膜移植片。并采用兩種方法進(jìn)行移植：A組用10-0尼龍線直接將構(gòu)建好的板層角膜移植片縫合到右眼植床，而B組則采用將構(gòu)建好的板層角膜移植片粘合與植床，再用10-0尼龍線縫合。結(jié)果顯示，將人眼SMILE角膜基質(zhì)透鏡經(jīng)過冰凍保存后構(gòu)建的角膜板層移植片移植到新西蘭白兔后，A組和B組均在術(shù)后3～5d上皮化完成。A組4眼和B組1眼角膜移植片在經(jīng)歷了早期輕微的免疫炎癥反應(yīng)后，1個(gè)月后保持移植片透明。而A組1眼和B組4眼在術(shù)后10d左右發(fā)生強(qiáng)烈的異種排斥反應(yīng)，組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示透鏡組織膠原纖維腫脹，4層透鏡間隙明顯，組織內(nèi)有大量的單核淋巴細(xì)胞浸潤及大量新生血管長入。簡言之，當(dāng)采用單純折疊構(gòu)建和尼龍線縫合的方法，經(jīng)過冰凍保存后的人角膜基質(zhì)透鏡移植到新西蘭白兔后產(chǎn)生的異種排斥反應(yīng)，可被局部2次/d的激素眼膏所抑制；而當(dāng)采用纖維蛋白膠（人纖維蛋白）粘貼后再縫合的方法，盡管降低了手術(shù)難度，但卻大大增加了異種排斥反應(yīng)的強(qiáng)烈程度。

國際上有多篇報(bào)道關(guān)于冰凍保存的供體角膜用于角膜移植的文獻(xiàn)[13-17]，結(jié)果顯示，經(jīng)過冰凍保存的角膜供體，無論是穿透性治療性角膜移植，還是深板層角膜移植，或周邊板層角膜移植術(shù)，術(shù)后均無同種異體排斥反應(yīng)的出現(xiàn)，獲得良好的臨床結(jié)果。2014年有研究報(bào)道經(jīng)冰凍保存法保存19～178d后再復(fù)蘇的角膜組織透鏡異體移植矯正9例遠(yuǎn)視患者，隨訪38～310d，評估患者的視力、光學(xué)相干斷層掃描成像、角膜地形圖和像差，臨床指標(biāo)結(jié)果顯示安全有效，無一眼矯正視力丟失[18]。這提示了SMILE角膜基質(zhì)透鏡經(jīng)冰凍保存后若進(jìn)行同種異體移植，也不會發(fā)生排斥反應(yīng)。本研究結(jié)果還提示，即使是異種移植，使用2次/d的激素眼膏也可抑制排斥反應(yīng)，移植片保持透明，但若加入人來源的纖維蛋白膠則可增加異種排斥反應(yīng)的發(fā)生概率和程度。

[1] Shimazaki J,Yang HY,Shimmura S,et al．Terrien's marginal degeneration associated with erythema elevatum diutinum[J]．Cornea,1998,17(3):342-344．

[2] Cheng CL,Theng JT,Tan DT．Compressive C-shaped lamellar keratoplasty:a surgical alternative for the management of severe astigmatism from peripheral corneal degeneration[J]．Ophthalmology,2005,112(3):425-430．

[3]Wang T,Shi W,Ding G,et al．Ring-shaped corneoscleral lamellar keratoplasty guided by high-definition optical coherence tomography and Scheimpflug imaging for severe Terrien's marginal corneal degeneration[J]．Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,2012,250(12):1795-1801．doi:10．1007/s00417-012-2042-4．

[4] Angunawela RI,Riau AK,Chaurasia SS,et al．Refractive lenticule re-implantation after myopic ReLEx:a feasibility study of stromal restoration after refractive surgery in a rabbit model[J]．Invest Ophthalmol Vis Sci,2012,53(8):4975-4985．doi:10．1167/iovs．12-10170．

[5] Riau AK,Angunawela RI,Chaurasia SS,et al．Reversible femtosecond laser-assisted myopia correction:a non-human primate study of lenticule re-implantation after refractive lenticule extraction[J]．PLoS One,2013,8(6):e67058．doi:10．1371/journal．pone．0067058．

[6] Lim CH,Riau AK,Lwin NC,et al．LASIK following small incision lenticule extraction(SMILE)lenticule re-implantation:a feasibility study of a novel method for treatment of presbyopia[J]．PLoS One,2013,8(12):e83046．doi:10．1371/journal．pone．0083046．

[7] Liu R,Zhao J,Xu Y,et al．Femtosecond laser-assisted corneal small incision allogenic intrastromal lenticule implantation in monkeys:a pilot study[J]．Invest Ophthalmol Vis Sci,2015,56(6):3715-3720．doi:10．1167/iovs．14-15296．

[8] Zhao J,Shen Y,Tian M,et al．Corneal lenticule allotransplantation after femtosecond laser small incision lenticule extraction in rabbits[J]．Cornea,2017,36(2):222-228．doi:10．1097/ICO．000000 0000001076．

[9]Pradhan KR,Reinstein DZ,Carp GI,et al．Femtosecond laserassisted keyhole endokeratophakia:correction of hyperopia by implantation of an allogeneiclenticule obtained by SMILE from a myopic donor[J]．J Refract Surg,2013,29(11):777-782．doi:10．3928/1081597X-20131021-07．

[10] Sun L,Yao P,Li M,et al．The safety and predictability of implanting autologous lenticule obtained by SMILE for hyperopia[J]．J Refract Surg,2015,31(6):374-379．doi:10．3928/1081597X-20150521-03．

[11] Jiang Y,Li Y,Liu XW,et al．A novel tectonic keratoplasty with femtosecond laser intrastromal lenticule for corneal ulcer and perforation[J]．Chin Med J,2016,129(15):1817-1821．doi:10．4103/0366-6999．186639．

[12] Yin H,Qiu P,Wu F,et al．Construction of a corneal stromal equivalent with SMILE-derived lenticules and fibrin glue[J]．Sci Rep,2016,6:33848．doi:10．1038/srep33848．

[13]Yao YF,Zhang B,Zhou P,et al．Autologous limbal grafting combined with deep lamellar keratoplasty in unilateral eye with severe chemical or thermal burn at late stage[J]．Ophthalmology,2002,109(11):2011-2017．

[14]Yao YF．A novel technique for performing full-bed deep lamellar keratoplasty[J]．Cornea,2008,27(Suppl 1):S19-24．doi:10．1097/ICO．0b013e31817f445f．

[15]Wu SQ,Zhou P,Zhang B,et al．Long-term comparison of fullbed deep lamellar keratoplasty with penetrating keratoplasty in treating corneal leucoma caused by herpes simplex keratitis[J]．Am J Ophthalmol,2012,153(2):291-299．doi:10．1016/j．a(chǎn)jo．2011．07．020．

[16] Yao YF,Zhang YM,Zhou P,et al．Therapeutic penetrating keratoplasty in severe fungal keratitis using cryopreserved donor corneas[J]．Br J Ophthalmol,2003,87(5):543-537．

[17]Huang D,Qiu W,Zhang B,et al．Peripheral deep anterior lamellar keratoplasty using a cryopreserved donor cornea for terrien's marginal degeneration[J]．J Zhejiang Univ Sci B,2014,15(12):1055-1063．doi:10．1631/jzus．B1400083．

[18]Ganesh S,Brar S,Rao PA．Cryopreservation of extracted corneal lenticules after small incision lenticule extraction for potential use in human subjects[J]．Cornea,2014,33(12):1355-1362．doi:10．1097/ICO．0000000000000276．