腸道病毒71型非編碼區結構與功能研究進展

董禎 溫紅玲

250012濟南,山東大學公共衛生學院微生物檢驗學系感染性疾病防控重點實驗室(山東省“十三五”高校重點實驗室)

自1969年在美國加利福尼亞分離出來至今，EV71已在全世界發生過多次暴發和流行，是亞太地區最嚴重的嗜神經病毒之一。EV71導致的手足口病(hand， foot and mouth disease，HFMD)大部分為自限性疾病，常表現為手足口部位的皰疹，重癥患兒可伴有腦炎、脊髓灰質炎樣急性遲緩性麻痹、腦干腦炎等神經系統并發癥，部分患者出現肺出血、肺水腫甚至心肺衰竭等其他嚴重的全身性疾病，致殘率及病死率較高[1-2]。近年來，EV71發病率仍呈上升趨勢，且重癥感染較多，對嬰幼兒的生命健康造成了嚴重的威脅[2-3]。EV71屬于小RNA病毒科腸道病毒屬A組，為單股正鏈RNA病毒，基因組長約7 400 bp，兩端分別是保守的是5‘UTR和3’UTR，中間是編碼一個多聚蛋白的開放閱讀框(open reading frame，ORF)。該多聚蛋白在自身蛋白酶的作用下水解為結構和非結構蛋白，在病毒感染過程中發揮各自作用[4]。研究顯示EV71的非編碼區可以與宿主相互作用，能在病毒RNA合成的起始階段及蛋白翻譯過程中對病毒感染發揮重要的調控作用。因此，研究EV71非編碼區結構與功能的關系，對于揭示其致病機理及病毒的生命活動具有重要意義。

1 EV71 5′非編碼區結構及功能

1.1 5′UTR結構 EV71的5′UTR是病毒基因組較為保守的區域，能折疊成復雜的二級結構，主要由6個莖環結構(stem-loop，SL)構成。臨近5′末端的莖環Ⅰ是三葉草樣結構(cloverleaf)，能與宿主蛋白發生相互作用，參與調控RNA的復制及合成，并且與維持病毒基因組結構的穩定性有關[5]。SLIISLVI共同組成內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site，IRES)，以不依賴帽子結構的方式與宿主細胞核糖體結合從而在病毒進入細胞后啟動病毒基因組的翻譯，并通過宿主因子調控病毒RNA的翻譯效率[6]。IRES中的SLIII和SLIV是相對保守的區域，SLII，SLV和SLVI則具有多變性，可能影響病毒毒力[7]。莖環結構內部含有三個C-rich區，一個在SLII之前，另外兩個位于SLIV中。在SLV的下游還有一個富嘧啶(pyrimidine-rich)區，富嘧啶區的下游有一個沉默密碼子AUG，不能啟動高效率的翻譯，而真正的翻譯起始位點AUG位于其下游約150 bp處[8]。目前，在IRES的SLVI和第一個AUG密碼子之間沒有預測到RNA二級結構，該區域被定義為“連接區”[9]。連接區可能通過與宿主蛋白相互作用調節IRES的活性進而調控病毒翻譯過程，但具體機制仍然未知。

1.2 5′UTR功能研究 小RNA病毒的IRES被分為4種類型，主要取決于它們需要輔助宿主蛋白在內部招募核糖體的程度。EV71的IRES已被證明在功能上類似于Ⅰ型IRES，能與多種宿主蛋白相互作用，對病毒的復制和翻譯至關重要[10]。遠端上游結合蛋白1(FBP1)通過正調節IRES活性可作為病毒翻譯的正調控因子，而最新研究表明遠端上游結合蛋白3(FBP3)能夠通過結合EV71 5′UTR作為IRES相關作用因子(ITAF)并負調節病毒翻譯[6，9]。poly(C)結合蛋白1(PCBP1)通過與5′UTR相互作用正向調節EV71復制，其中SLI和SLIV空間結構對PCBP1與病毒RNA結合尤為重要，可能影響病毒復制能力[11]。此外，異源核糖核蛋白(hnRNP)家族的成員，例如，聚嘧啶結合蛋白(PTB)，poly(C)結合蛋白2(PCBP2)，富含 AU的元件結合因子1(AUF1)等均被發現充當ITAF，通過與5′UTR不同區域結合直接調節IRES活性，但具體機制有待進一步研究[9，12]。

研究表明5′UTR某些位點突變可能使病毒復制能力、嗜神經性甚至毒力發生一定的變化。Ma等[13]通過比較置換了5′UTR的EV71重組病毒與原病毒的生長曲線后發現，5′UTR能夠影響EV71復制能力且高溫下病毒復制能力有所下降，這提示可能存在EV71毒力位點或者高溫敏感位點。Yeh等[14]在EV71基因組的5′UTR的第158位點處進行點突變(C158U)后發現病毒復制能力降低，進一步通過ICR小鼠實驗發現病毒致病力減弱，這說明C158位點是EV71的毒力決定位點。張慧娟等[15]通過多個病毒序列比對發現，在5′UTR區中第254位堿基的突變(A254G)可能與EV71感染后引起的不同臨床癥狀有關。袁曉晶等[16]通過對EV71不同表型毒株基因組序列比對發現，分離自中樞神經系統(CNS)累及的6個病毒株在5′UTR區第265 nt、703 nt兩處均發生了變異(G265A，G703T)，而輕癥HFMD來源的病毒株在該位點未發生變異。這些研究說明5′UTR某些位點突變能夠引起不同臨床結局，可能與EV71的致神經毒性作用有關，可作為潛在的毒力位點進一步研究。

Wen等[16]通過基因序列對比發現EV71輕癥株和重癥株5′UTR之間的二級結構具有明顯區別。Li等[17]比對25株EV71重癥分離株與31株輕癥株的序列發現5′UTR內3處堿基位置上的核苷酸(nt272G，nt488U，nt700 A/U)發生了一致性改變，二級結構分析顯示nt488U突變引起SLIII的穩定性發生改變，進而導致病毒毒力變化引起不同表現型。Kok等[18]將 EV71的 5′UTR替換成鼻病毒(rhinovirus)的5′UTR后發現病毒復制能力變弱，然而多次細胞傳代后恢復了親本的復制能力，分析其二級結構認為U461C突變增加了SLV區域GC配對含量，使二級結構更穩定，從而提高了翻譯效率使得病毒復制增強。Jia等對EV71強毒株的IRES二級結構預測表明，GP114→CP114和GP151→TP151突變有助于在SLII中形成獨特的RNA二級結構，可能導致病毒毒力增強[19]。最新研究表明，SLII內部堆疊形成保守的5′-AUAGC-3′凸環結構是病毒翻譯和復制的關鍵決定因素，當內部堿基突變后病毒復制能力降低，刪除凸環結構則病毒完全失去感染RD細胞的能力[20]。人異源核糖核蛋白(hnRNP A1)與SLII相互作用形成特異性復合物，SLII凸環等結構突變能改變復合物的穩定性，嚴重影響病毒翻譯和復制能力[21]。另有研究初步表明，從重癥以及死亡患者分離出的EV71毒株的5′UTR RNA二級結構比輕癥毒株的二級結構更加復雜和緊湊，尤其是在IRES的SLIV區，且重癥株有比輕癥株具有更多莖環結構[22]。目前對EV71復制能力及毒力與5′UTR二級結構改變的關系研究逐漸增多，但由于其序列復雜且結構具有高度靈活性，其三維結構仍然未知，今后對空間三維折疊構象的深入分析是必不可少的一方面。

研究發現位于三葉草結構與SLII之間的非莖環結構區內第104位堿基是柯薩奇病毒16型(CA16)的毒力決定位點，與病毒復制有關并且影響由IRES介導的翻譯活性[23]。同一區域內，脊髓灰質炎病毒(poliovirus，PV)第103位堿基由A突變為C后病毒的毒力發生衰減，并且喪失了在神經細胞上的溫度敏感表型[24]。另有研究者發現，在三葉草結構與IRES之間的部分堿基與三葉草結構之間存在協同作用，通過增加宿主蛋白結合的能力調節病毒復制[25]。另外，對于連接區研究較少，目前認為連接區可以促進IRES三級結構的形成，對病毒構象有重要意義，該區域的變異可能對毒力也有一定影響。這提示我們不能忽略對IRES以外的其他區域的堿基突變和空間結構的關注。

2 EV71 3′非編碼區結構及功能

2.1 3‘UTR結構 EV71的3’UTR也是高度保守的非編碼區的一部分，它具有多種高度復雜的空間結構，此區域可能包含病毒基因組復制的調控位點。3′UTR的核心結構是由堿基互補配對折疊形成的兩個莖環結構域(stem-loop domains，SLDs)，分別稱為X和Y。這兩個結構域的長度是保守的，分別由8個堿基對和12個堿基對組成。3′UTR一端由遺傳編碼的poly(A)尾部組成，其部分包含在結構域X的莖中[26]。X和Y結構域的環區與環外的堿基配對可進一步形成互補假結體，把這種能相互作用并且類似“吻型”(kissing interaction)的高級結構命名為結構域K。結構域K的穩定性不高，常以變換折疊的不同結構存在。近期研究發現，3′UTR除了X和Y兩個莖環外還具有特殊的“Z型”結構域(SLDZ)。根據核苷酸序列的長短分為兩組，EV71 B3和C4亞型與 CVA4，CVA14和 CVA16等攜帶Ⅰ組SLD-Z，EV71原型株BrCr與其余亞型都攜帶Ⅱ組SLD-Z。實驗數據表明，SLD-Z是EV71和A型柯薩奇病毒16(CVA16)進化重組的標記[18，27]。值得一提的是，SLD Z的缺失能夠導致病毒在神經元細胞(SH-SY5Y)的特異性生長缺陷，很可能與神經毒力有關[28]。“Z型”結構域在病毒的復制過程中也可能發揮其他作用，但目前未見報道。

2.2 3′UTR功能及探究 目前研究認為，3′UTR可能與病毒的進化和適應存在一定關聯，部分序列結構缺失可能導致病毒感染性降低[29]。Kok等[18]刪除EV71和鼻病毒2嵌合體的3′UTR的17個堿基后，病毒的生長能力大幅度下降。Brown等[30]構建了刪除鼻病毒和PV的3′UTR的缺失突變體，然后用突變體感染Hela細胞，結果表明缺失突變體感染HeLa細胞的能力降低，細胞出現病變的時間推遲[30]。

作為非編碼區的一部分，3′UTR二級結構對RNA的起始要比堿基組成對于RNA的起始更為重要，增加二級結構穩定性可以提高翻譯中涉及的蛋白質的結合，這又可以提高翻譯效率。有研究發現，結構域K內個別堿基錯配造成的扭曲能導致病毒對溫度敏感甚至死亡，如果結構域K中一條鏈被互補相似物取代則病毒復制被阻斷[31]。這種特殊的結構域K可能為翻譯起始因子和核糖體相互識別提供了結合位點，也可能激活IRES活性進而影響病毒翻譯過程，對EV71結構域K的功能研究需要找到特定作用位點再聯合其三維結構進一步分析。目前，對3′UTR結構和功能的研究還處于起步階段，常用手段就是結構預測后進行突變分析。但是對3′UTR功能的剖析常常受到病毒復制過程中各種因素的阻礙，我們需要通過進一步研究來明確EV71與宿主的相互作用及其空間構象變化對病毒的影響機制。

3 小結

在過去的幾十年里，國內外學者對小RNA病毒基因組非編碼區的結構和功能進行了大量研究，其研究成果對我們了解EV71病毒基因組的復制，蛋白翻譯及病毒包裝釋放等生命過程具有重要意義。EV71高度保守且空間結構復雜的非編碼區在入侵宿主細胞后的翻譯及復制過程中的作用不可或缺的，能直接或間接影響病毒的毒力和感染力。隨著對EV71研究的逐漸廣泛深入和研究技術的日益發展，非編碼區的功能及分子機制將逐步揭示。

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