雞傳染性支氣管炎病毒實驗室檢測方法研究進展*

莊金秋 ，阮震 ，張穎 ，梅建國 ，苗立中

（1.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600；2.濱州市濱城區里則街道辦事處畜牧獸醫工作站，山東 濱州 256656）

雞傳染性支氣管炎 （Avian infectious bronchitis，IB）是由冠狀病毒科冠狀病毒屬的雞傳染性支氣管炎病毒 （Infectious bronchitis virus，IBV）引起的雞的一種急性、高度接觸性、呼吸道傳染病。IBV主要侵害雞的呼吸系統、泌尿生殖系統和消化系統，引起呼吸道疾病、腹瀉以及產蛋雞產蛋數量和質量下降、肉雞群的增重和飼料轉化率降低，并可致雛雞死亡。該病首先由Shalk等人于1931年在美國首先報道，我國鄺榮祿等人于1972年首次在廣東報道[1]。IBV呈世界性流行，是危害養禽業發展的重大傳染病之一，給世界養禽業造成了嚴重的經濟損失。IBV不斷變異，目前已發現30多種血清型，不同血清型的IBV之間僅有部分或完全沒有交叉免疫保護，且伴有混合感染、繼發感染等因素，給IB的免疫預防和診斷帶來了很大困難。因此，為有效地控制IBV的流行，建立快速準確的檢測方法以區別不同IBV血清型致病毒株具有重要意義。本文從該病的病原分離和鑒定、血清學及分子生物學等方面對IB的實驗室檢測方法最新研究進展進行了綜述。

1 病毒分離與鑒定

病毒分離鑒定是檢測病原的金標準。IBV一般從病雞的氣管、肺臟、腎臟、扁桃體、泄殖腔等組織采樣，在SPF雞胚、雞氣管組織培養物（TOC）和細胞上進行培養。IBV在這三種培養系統中引起的病變都不具有特異性，需要與電鏡觀察、PCR、間接免疫熒光（IFA）等檢測技術結合使用，這樣不僅可以提高檢測的特異性，也能減少檢測時間。

1.1 雞胚接種 雞胚接種是分離IBV最常用的方法，將處理好的病料接種9～11日齡SPF雞胚，接種后36～48h，尿囊液中的病毒滴度達到最高，非胚適應性野毒株出現峰值的時間可能會延遲。當出現典型侏儒胚且尿囊液血凝試驗（HA）和雜菌檢驗呈陰性時，即初步認為分離出IBV。李康然等[2]（1990）從廣西地區 13 個雞場分離出 C、G、Z、Q四株病毒，接種雞胚后在6～7d出現了矮小、蜷縮的侏儒胚。IBV引起的雞胚病變因毒株和代次的不同而有所差異。通常毒力強、傳代次數高的毒株引起的病變更加明顯。雞胚接種雖然是分離IBV的常規方法，但費時、費力，勢必會延誤病程的及時診斷和治療。

1.2 氣管環接種 氣管環培養是IBV分離、效價測定和血清分型的有效方法，特別適合觀察IBV對氣管的破壞作用。一般采用18～20日齡的SPF雞胚制備氣管環，接種氣管環后36h左右即可以看到纖毛擺動停止，上皮細胞脫落、萎縮等病變，并在3～5d左右病毒達到最高滴度。對于初次分離的臨床病料，不需在氣管環上適應，即可引起氣管纖毛擺動停止或活性下降等。楊娜等[3]（2010）將雞胚接種和氣管環接種相結合，把被IBV感染的尿囊液注入氣管環培養液中，傳一代即可證明IBV的存在，大大縮短了IBV的分離時間。

1.3 細胞培養 IBV在細胞中復制并誘導細胞病變效應（CPE）必須有一段適應過程，使用常規細胞進行培養往往不能從病料中分離病毒，但Vero細胞、氣管上皮細胞（CTE）、雞胚腎細胞（CEKC）等對適應性IBV毒株有很高的敏感性。IBV在細胞上的CPE主要有細胞變圓、形成合胞體等。孫裴等[4]（2008）將 IBV M41毒株接種于 CTE細胞，72h時有30%以上的細胞脫落，出現明顯的CPE。李華偉等[5]（2011）將其接種于CEK細胞，36h后細胞開始變圓、固縮、脫落聚集成團等病變。

1.4 電鏡檢測 IBV的電鏡檢測直觀、準確，一般與以上三種培養方法相結合從而鑒定IBV的存在與否。將感染IBV的雞組織器官或分泌物做常規負染色進行電鏡觀察，可見IBV病毒粒子呈球形，直徑為80～120nm，有囊膜，囊膜表面有纖突。電鏡觀察直觀、快速，但電鏡儀器昂貴，一般實驗室很難普及。

2 血清學檢測方法

2.1 血凝和血凝抑制試驗（HA&HI） 血凝和血凝抑制試驗可用于檢測IBV抗原及抗體。IBV本身沒有血凝性，但經一定處理后會產生血凝現象。Bingham[6]（1975）首次發現IBV M41株經過Ⅰ型磷脂酶C（PLC I）處理后能凝集雞紅細胞，而這種凝集作用可被特異性的抗血清所抑制。King等[7]（1983）建立IBV的HI試驗，并將其標準化，從而為IB的診斷提供了一種簡單、快速、特異性強的血清學方法。吳延功等[8]（1994）證實IBV用PLC I的兔A型魏氏梭菌培養液處理后同樣能凝集雞的紅細胞。陸蘋等[9]（2003）研究發現，用1%胰蛋白酶處理尿囊液來制備抗原，結果檢測IBV的靈敏度和特異性更強。在國外HI試驗已成為一種標準的診斷方法，與病毒中和試驗（VN）相比可能更易更早檢出抗體。但由于HI抗原制作復雜，抗原效價不穩定，病毒濃度與HA滴度不呈線性關系，HI滴度與保護力在免疫期無相關性等缺點，故該方法用于IBV免疫監測仍需進一步完善和深入探討。

2.2 瓊脂擴散試驗（AGP） AGP試驗具有操作簡便、快速、特異性強、費用較低、不需要特殊儀器等優點，已被廣泛應用于IBV抗體檢測。封文海等[10]（1993）、王紅寧等[11]（1996）先后認為 AGP 可用作IB快速定性和定量檢測。杜恩歧等[12]（2003）用IBV LX4毒株N基因進行誘導表達后獲得包涵體，純化蛋白后免疫所得多抗與不同型毒株進行AGP，結果表明該抗體可與不同毒株發生反應，說明重組蛋白可作為群特異性診斷抗原用于IBV的診斷。IBV抗原的處理和濃度是AGP成功的關鍵因素。AGP抗體陽性率與病毒的致病性、病毒的感染劑量、雞的日齡及感染時抗體的存在狀態有關。群特異性的AGP快速而簡單，花費少，只需要極少的實驗器械，即可獲得最佳的結果，但AGP的敏感性差，不能區分疫苗株和自然感染毒株等缺點而限制了其在實際中的應用。

2.3 病毒中和試驗 （VN） VN試驗是鑒定IBV的經典方法，可在雞胚、CEKC或氣管環培養物上進行，廣泛用于IB野毒株的分離和鑒定及血清分型。吳延功等[13]（1995）通過對IBV在CEKC和氣管環組織培養物上的適應性的比較，證明氣管環比CEKC更適用。吳全忠等[14]（1998）用雞胚氣管環培養物的纖毛運動為指示系統，進行了不同IBV毒株與血清的交叉中和試驗，證實氣管環中和試驗比雞胚VN更準確、簡單、直觀。秦卓明等[15]（2000）用氣管環交叉VN試驗成功地鑒定IBV山東分離株的血清型。氣管環中和試驗雖然靈敏度和特異性均較好，但是操作復雜、費時、價格昂貴且需要較高的實驗室條件。

2.4 熒光抗體技術（FA） FA法可用于IBV抗原抗體檢測及抗原組織定位的研究。封文海等[16]（1994）建立 IFA 法檢測 IBV。 朱建國等[17]（1996）建立了單抗介導的IFA法。劉興友等[18]（1997）采用胰酶分散法制備抗原，建立IFA法，檢測結果與冰凍切片制備抗原建立的IFA完全一致。劉思國等[19]（2000）應用IFA法對IBV感染后SPF雞不同臟器進行了跟蹤檢測。結果發現，在IBV感染后的第7d，在氣管、腎臟、脾臟、肺臟和肝臟等組織細胞中均不同程度地出現特異性的熒光。FA方法具有直觀、特異等特點，在抗原定位上具有獨特的優點，但需熒光顯微鏡及較嚴格的時間限制。

2.5 酶聯免疫吸附試驗（ELISA） ELISA具有特異性強、敏感性高、操作簡便以及在短時間內可以進行大量樣本的檢測和結果可靠等優點，已被廣泛應用于IBV抗原和抗體的檢測。IBV由4種主要結構蛋白組成：核蛋白（N）、纖突蛋白（S）、膜蛋白（M）和小囊膜蛋白（E）。N蛋白在進化上保守，誘導產生較強的交叉免疫反應，可以檢測群特異性抗體。S蛋白是IBV最重要的保護性抗原，可以被裂解為S1、S2兩個糖基化蛋白，S1蛋白是誘導機體產生中和抗體和血凝抑制抗體，且在各血清型之間具有交叉反應。M蛋白為群特異性蛋白，保守性高，在IBV檢測中起著重要作用。E蛋白在IBV感染細胞中大量存在，與感染細胞的細胞凋亡有關，另外在病毒復制過程中，E蛋白與M蛋白協同作用，參與病毒樣顆粒 （virus-like particle，VLP）的形成和出芽，VLP在IBV的黏膜免疫中發揮作用。

2.5.1 間接ELISA 間接ELISA是最常用的抗體檢測方法，主要用于IgM和IgG抗體的檢測。李鋒等[20]（1992）、磨美蘭等[21]（2009）用純化的 IBV 全病毒蛋白作為包被抗原建立了檢測IBV抗體的間接ELISA，其靈敏度是VN的2.3倍，AGP的188倍。許蘭菊等[22]（1997）用同種方法建立的ELISA檢測54群發病雞，其抗體陽性率為100%。王君瑋等[23]（2004）建立了檢測IBV IgG和IgM抗體的間接ELISA。陳萍[24]（2005）、付潤饒[25]（2014）、鄭衛峰等[26]（2015）也先后建立了IBV全病毒抗原的間接ELISA方法，用于疫苗免疫后雞血清中特異性抗體的檢測。Chen 等[27]（2003）、 郝春麗[28]（2007）、 呼延蓉[29]（2010）、李廣興等[30]（2014）先后以 IBV 重組表達的N蛋白作為包被抗原，建立了檢測IBV抗體的間接ELISA方法，為IB快速診斷和流行病學研究奠定了基礎。Gibertoni等[31]（2005）、孫羅美等[32]（2012）、苗立中等[33]（2017）先后以 IBV 重組表達的S1蛋白作為包被抗原，建立了檢測IBV抗體的間接ELISA方法。王宏俊等[34]（2003）利用重組N蛋白作為包被抗原，建立了檢測IBV抗體的間接ELISA方法。Wang等[35]（2002）利用重組IBV的N蛋白和部分S蛋白作為包被抗原，建立了檢測IBV抗體的間接 ELISA。Ding等[36]（2015）人工合成了選自IBV的S蛋白、M蛋白和N蛋白的多片段抗原作為包被抗原，建立了檢測IBV抗體的間接ELISA。間接ELISA為IBV的免疫抗體監測、臨床野毒感染快速診斷和流行病學調查提供了一種敏感、特異、高通量的檢測技術。

2.5.2 斑點ELISA（Dot-ELISA） 該方法是一種以硝酸纖維素膜等固相化基質膜為載體的ELISA，用于檢測抗體或抗原。劉紅等[37]（1998）建立了Dot-ELISA檢測IBV，對病毒的最低檢出量為0.0124mg/ml，不僅檢測純化的病毒，而且可直接用于檢測雞胚尿囊液或病變組織，可作為IBV的早期診斷。王樂元[38]（1993）成功建立了檢測IBV抗原的間接Dot-ELISA，對IBV抗原的最低檢出量為 1.36μg/ml。 王富曉等[39]（1999）建立了單克隆抗體介導的夾心法Dot-ELISA，對IBV抗原的最低檢出量為 0.5μg/ml。 閻芳等[40]（2000）將生物素、親和素系統與Dot-ELISA相結合，建立了ABCDot-ELISA檢測IBV的方法。對自然感染和人工感染的病料均取得了較好的檢出率，分別達到70%和85%左右，顯著高于AGP。云長曄等[41]（2000）建立的Dot-ELISA方法，檢測 IBV雞胚毒40份，陽性檢出率100%。人工感染發病雞的氣管、泄殖腔拭子樣品各50份，陽性檢出率分別為100%和92%。

2.5.3 夾心ELISA及雙抗體夾心ELISA 該方法分別利用多克隆抗體、單克隆抗體（MAb）作為一抗、二抗，并采用標記抗鼠IgG的為指示系統建立的ELISA，用于IBV抗原早期感染的檢測，并且可以區分病毒株或血清型。該法比較適合于檢測病料和感染雞胚尿囊液中的IBV，要求病料中病毒含量TOC半數感染量為10-5時方能夠檢出。劉濱東等[42]（1997）用MAb夾心ELISA檢測結果明顯高于傳統的雞胚氣管環法及雞胚傳代方法。王川林等[43]（2001）認為以單抗包被反應板要優于用多抗、病毒包被反應板。季文彬[44]（2017）建立檢測IBV的雙抗體夾心ELISA，特異性好、可重復且檢測結果可靠，為IB防控提供了良好的診斷方法。

2.5.4 捕獲ELISA 白妍[45]（2016）利用制備的IBV B11株單抗成功建立和優化抗原捕獲ELISA方法，具有很好的敏感性和特異性，適合大規模樣本的快速檢測。

2.6 膠體金免疫層析技術（GICA） 王澤霖等[46]（2005）采用膠體金標記純化的羊抗鼠IgG，建立了一種對IBV進行檢測的銀加強金標免疫技術（SECGA），該技術不需特殊設備，快速、簡便，被認為是微生物診斷技術標準化最有前途的新技術之一，但其缺點是對金標二抗的濃度和活性要求很高。蘇磊等[47]（2008）利用IBV單抗及兔抗IBV多抗建立了用于檢測IBV的免疫膠體金診斷試紙條技術，該技術通過與IBV雙抗夾心ELISA法比較，具有較高的特異性、靈敏性、穩定性，并且可在加入待檢樣品15min后即可判定結果。夏昕[48]（2010）、鄭衛峰[49]（2016）成功制備了能 檢測 IBV的免疫膠體金快速檢測試紙條，為IB的早期診斷和防治以及與其它禽類呼吸道感染的快速鑒別診斷提供了有力的技術手段。

2.7 對流免疫電泳技術（CIE） 王紅寧[11]（1996）在國內首先采用CIE技術對128份人工感染雞樣品進行IBV抗體檢測，與AGP試驗相比，極大地提高了試驗的靈敏度（16～20倍），適宜于雞群的大規模抗體監測。王川慶等[50]（1997）利用CIE技術來檢測IB，結果證明該技術與VN、HA/HI等相比可縮短20倍以上的時間，可用作IB的快速定性和定量檢測，但該方法還不能做血清分型和區分強、弱毒株。

2.8 斑點免疫金測定法（DIGFA） DIGFA是在Dot-ELISA方法的基礎上發展起來的一種新的免疫學技術，不需要特殊試驗條件，結果客觀，肉眼易于判斷，是一項很有前途的新技術。李新生等[51]（1996）首次進行了DIGFA法檢測IBV的研究，結果表明DIGFA法對IBV的早期診斷具有簡便、靈敏、快速、特異性強和重復性好等優點。該法在實現商品化后，適合于廣大基層單位推廣與應用。

3 分子生物學檢測方法

3.1 RT-PCR RT-PCR方法具有敏感、特異、快速等特點，既可利用通用引物檢測不同來源、不同血清型的IBV，對于某些差異較大的毒株也可通過設計型特異性引物區分不同的IBV毒株。針對變異率較高的S1蛋白等設計引物可以實現血清型或基因型的特異性擴增；而針對N、M等保守區域設計引物則可以實現群特異性擴增。Keeler等[52]（1998）設計了S1基因的通用性引物和6個型特異性引物，成功擴增了來自于北美、歐洲及澳大利亞的共31個分離株的S1基因并且進行了區分。Adzhar等[53]（1996）針對IBV的S2基因和N基因設計了通用性的7對引物，檢測了來自歐洲、日本和美國的IBV病料。王林川等[54]（1994）率先在我國采用RT-PCR技術檢測廣東分離的IBV。陸蘋等[9]（2003）、劉金朋等[55]（2011）等根據 IBV N 基因序列設計引物，建立了RT-PCR方法。于申業等[56]（2007）根據IBV 793/B株S1基因序列設計引物，建立了檢測IBV 793/B的RT-PCR方法。周生[57]（2002）對四川分離的多株IBV S1基因和N基因用RT-PCR進行了擴增，表明建立的方法適用于不同來源及不同血清型IBV的檢測。孟凡磊[58]（2007）根據 IBV N基因和 S1基因（793/B）分別設計兩對引物，建立了雙重RT-PCR方法，只需一次PCR反應，就能檢測IBV和鑒定出793/B型。程曉霞等[59]（2009）根據 IBV M基因設計引物，建立了檢測IBV的RT-PCR方法。姚四新等[60]（2013）根據IBV ZZ20043a、3b及E基因序列設計引物，建立了檢測IBV ZZ2004變異株的RT-PCR方法。潘盛[61]（2006）通過在IBV非結構基因3abc的保守區域設計引物，建立了RT-PCR并組裝成試劑盒。磨美蘭等[62]（2009）建立了檢測IBV的巢式 RT-PCR方法。高文倩等[63]（2017）根據IBV強毒株和弱毒疫苗株序列差異設計引物，建立了一種基于免疫磁珠富集IBV后檢測S1基因多變區的多重RTPCR方法，可以快速鑒別IBV強毒株和弱毒疫苗株，為IBV檢測提供了新的技術支持。

3.2 熒光定量RT-PCR 實時熒光定量RTPCR與普通RT-PCR相比，其特異性和靈敏度都更高，為IBV感染的快速檢測提供了一種新的方法。崔沛[64]（2007）首次在國內建立了對IBV的實時熒光RT-PCR檢測體系。劉喬然等[65]（2008）、磨美蘭等[66]（2011）、王鵬等[67]（2013）先后根據 IBV N 基因設計引物建立了檢測IBV的SYBR GreenⅠ熒光定量RT-PCR方法。于新友等[68]（2015）根據IBV M基因保守序列設計引物，建立了IBV SYBR Green I熒光定量RT-PCR方法。苗立中等[69]（2017）根據IBV E基因設計引物，建立了SYBR GreenⅠRT-PCR方法。梁耀峰等[70]（2012）根據 IBV N基因序列設計特異的H52株熒光定量RT-PCR檢測引物和Taq Man-MGB探針，建立了快速檢測IBV H52株檢測方法。屈素潔等[71]（2014）在國內首次針對IBV的N基因和NDV的NP基因設計引物和TaqMan探針，建立了同時檢測IBV和NDV的雙重熒光定量RT-PCR，實現了多種病原的同時檢測。

3.3 環介導逆轉錄等溫擴增技術（RT-LAMP）RT-LAMP技術是建立在基礎RT-PCR基礎上的一種新型核酸檢測方法，具有簡便、快速高效、敏感性強等優點，適合基層業務部門及養殖場的檢測，為IBV感染的快速檢測提供了新方法。劉程[72]（2012）、劉宇卓等[73]（2013）先后根據 IBV 的 M 基因設計引物建立了RT-LAMP方法，其檢測極限比建立的RT-PCR更高，具有良好的特異性和敏感性。馬利[74]（2012）根據 IBV的 5a+5b基因序列設計引物；范瑾[75]（2013）根據IBV M基因設計引物；鮮思美等[76]（2014）根據IBV N基因設計引物，分別建立了檢測IBV的RT-LAMP方法。

3.4 核酸探針技術 核酸探針技術具有高度特異、敏感、快速、簡便等優點。 Kwon[77]（1993）應用PCR和生物素標記的DNA探針檢測了接種IBV的SPF雞氣管中的IBV基因組，發現此法敏感度比電鏡觀察高。朱國強等[78]（1996）利用此技術確診了江蘇流行的腺胃型IB。王澤霖等[79]（2000）用其標記IBV標準強毒株M41株和T株的S1基因探針與IBV的RNA提取物進行斑點雜交，結果表明該探針與已知IBV毒株均呈陽性反應且具有較高的敏感性。孟凡磊等[80]（2007）根據IBV N基因序列設計引物，成功制備出地高辛標記的IBV核酸探針，對IBV的最低檢出量為10pg。莫勝蘭等[81]（2007）用地高辛標記IBV pol基因的保守片段并制作探針，克服了RT-PCR非特異性反應和探針Northern雜交的不穩定性。

3.5 基因芯片技術 基因芯片技術是近年來分子生物學與微電子學等多學科交叉融合而成的一項高新技術，檢測疾病具有高通量、并行性和結果判讀客觀、準確和信息化等特點。曹三杰等[82]（2006）首次成功制備了NDV-IBV-AIV-IBDV基因芯片。趙玉佳等[83]（2015）構建了聯合檢測NDV、IBV、ILTV 的基因芯片。 楊國淋等[84]（2016）則在此基礎上將不對稱PCR和基因芯片結合，同時增加cy3標記引物的濃度，從而提高了芯片探針與靶基因的雜交效率和靈敏度。基因芯片技術克服了常規生物學方法僅能對少數靶標基因檢測的缺點，減少了對結果判斷的主觀因素，能夠同時對多種混合感染的疾病進行診斷。

3.6 限制性酶切片段長度多態性技術（RFLP）RFLP是一種通過病毒基因限制性酶切圖譜進行分型的方法，該法新穎，重復性好，可用于IBV從分子水平上進行了分型。Kown等[76]（1993）對IBV S1基因的RT-PCR擴增產物，經限制性內切酶消化后電泳，根據電泳圖譜對25株IBV進行了分類，結果得到了與VN相一致的結論。王林川等[85]（1997）、磨美蘭等[86]（2001）先后用 RFLP 分析對IBV進行了血清分型研究。

4 小結

本病目前尚無特效療法。盡管已有多種商品化疫苗用于IBV免疫預防，但由于IBV的基因組核酸在復制過程中易發生突變和高頻重組，從而導致該病毒血清型眾多，變異株不斷出現，且不同血清型之間交叉保護力弱，常導致免疫失敗，使得IB難以控制，給世界養禽業帶來巨大經濟損失。臨床上IB與新城疫、禽流感、傳染性喉氣管炎、傳染性鼻炎等病的癥狀類似，單憑臨診剖檢往往不能做出準確的診斷，必須依靠實驗室診斷。目前IB病原學、血清學、分子生物學檢測方法的研究在廣度和深度上已有了較大進展，但各種方法各有優缺點，每一種方法都難完全做到快速、簡便、靈敏、特異、經濟和實用。在檢測中可以根據實際需要，結合實際條件和操作經驗，選擇適宜的檢測方法或將幾種方法結合起來用，以取得很好的效果。相信隨著IB實驗室檢測技術的不斷研究與應用，尤其是IBV分子生物學研究的更加深入，IBV的檢測技術將會得到不斷發展和完善。