酶聯免疫吸附試驗簡析

劉紅祥，孔憲好，鐘聲

(青島易邦生物工程有限公司，山東 青島 266000)

近年來，畜牧業在國家調控政策及市場需求影響下得到快速發展，但隨著世界范圍內養殖業規模的不斷擴大，疾病對養殖危害也隨之加劇，某些常規檢測技術已經不能適應行業快速發展需求，伴隨著檢測技術的進步，ELISA技術以其靈敏度高、特異性強、操作步驟簡單快捷、安全性高、污染少等優點越來越應用廣泛，在疾病診斷、免疫效果評價方面具有實際指導意義。

1 ELISA原理

1.1 使抗原或抗體結合到固相載體表面，并保持其免疫活性。

1.2 使抗原或抗體與酶結合成酶標抗原或抗體，并保持抗原或抗體的免疫活性和酶的活性。

1.3 酶標的抗原或抗體與相應的抗體或抗原反應后，結合在免疫復合物上的酶催化底物形成水解、氧化或還原反應，形成有色物質，顏色的深淺與標本中受檢物質的量直接相關，由此進行定性或半定量分析。

2 ELISA方法

2.1 方法一：雙抗體夾心法 其步驟見圖1。

圖1 雙抗體夾心法

2.1.1 固相載體包被的是特異性抗體或抗原，多數檢測的是抗原為主，大分子抗原應用較多,如家禽的P27抗原檢測（IDEXX)。

2.1.2 顏色反應為有明顯顏色為陽性。

2.2 方法二：間接法 其步驟見圖2。

圖2 間接法

2.2.1 固相載體包被的是特異性的抗原，檢測的是抗體，如目前家禽傳染性支氣管炎（IB）、呼腸孤（REO）、傳染性法氏囊（IBD）、雞毒支原體（MG）、滑液囊支原體（MS）、禽肺病毒感染（APV）、禽腦脊髓炎（AE）的 ELISA 抗體；家畜藍耳病（PRRSV）、豬圓環病毒病PCV2、口蹄疫（FMD）的ELISA抗體等。

2.2.2 顏色反應為有明顯顏色為陽性，且顏色的深淺可以反應抗體的高低。

2.3 方法三：競爭法 其步驟見圖3。

圖3 竟爭法

2.3.1 固相載體包被的是特異性的抗體或抗原，可以檢測抗體也可以檢測抗原。如家畜中豬瘟抗體，偽狂犬GB/GI抗體等。

2.3.2 顏色反應為有明顯顏色為陰性，反之為陽性。

3 ELISA操作注意事項

3.1 實驗前注意要點

3.1.1 移液器、滴頭 移液器定期及時校正，保證微量加樣的準確性；滴頭一次性使用。

3.1.2 試劑盒的預溫 實驗室溫度控制在20～25℃的前提下，提前2h預溫，保證試劑盒中的各組分溫度均一。

3.1.3 洗液的配制 根據試劑盒的要求提前進行稀釋且使用時恢復至室溫，如IDEXX 10*。

3.1.4 血清樣品的預處理 血清保證新鮮，2～8℃保存不超過7d；長期保存需冷凍，避免反復凍融以免影響效價；血樣溶血勿用，紅細胞釋放的具有過氧化物酶活性的物質可造成非特異性的顯色反應；血樣盡量無菌以免產生假陽性；解凍后血清要輕柔顛倒混勻，避免強烈震蕩，如渾濁要離心取上清使用。

3.1.5 血清樣品稀釋 根據試劑盒的要求對血樣進行相應的稀釋（如：禽 500倍，豬2倍、5倍、40倍、100 倍）。

特別注意取樣時要準確且滴頭外壁的殘留血清要剔除，加樣后要切記混勻。

500倍稀釋方法見以下三步：

第一步：10μl血清加入到 90μl的稀釋液（10倍）；第二步：取10倍稀釋的樣品加入到 90μl的稀釋液（100倍）；第三步：取 100倍稀釋的 20μl的樣品加入到80μl的稀釋液中（500倍）。

3.2 實驗中注意的要點

3.2.1 加樣 稀釋好的樣品加入時懸空或不貼底壁，加樣在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁的上部，加入過程中不可產生氣泡，保證每孔中液體相同。

3.2.2 孵育 保證孵育溫度的適宜，ELISA板不要直接在溫度偏低的試驗臺面上孵育，還要加蓋或封膜板。

3.2.3 洗滌 稀釋好的洗液室溫下洗板且不能溢出，每次洗板的過程中要垂直甩板，甩干凈且在反應孔沒有干的情況下加入下一步試劑，試驗操作中避免手接觸反應板底部，以免影響實驗結果。

3.2.4 酶標抗體、底物、終止液 酶標抗體剩余不能倒回原瓶，底物應避光使用。

3.2.5 酶標儀讀數 酶標儀提前15min開啟，且加完終止液后15min內讀數，正確使用相應波長濾光片且定期校正檢查濾光片。