膠乳散射免疫比濁法檢測脂蛋白磷脂酶A2方法學評價

張晨

（南通大學附屬海安醫院中心實驗室 江蘇 南通 226600）

脂蛋白相關性磷脂酶A2是磷脂酶A2超家族的成員。循環中的脂蛋白相關性磷脂酶A2（Lp-PLA2）是一種主要由巨噬細胞產生的反映血管炎癥的特異性標記物，在低密度脂蛋白的氧﹑促進動脈粥樣硬化以及冠心病和卒中的形成等方面發揮重要作用[1]。脂蛋白相關性磷脂酶A2水平升高是預測冠心病和卒中風險的一種獨立危險因子。因此近年來相關研究不斷，為了常規開展Lp-PLA2檢測，最大程度地應用于臨床，我們參考美國臨床和實驗室標準協會（CLSI）的相關文件[2]，對乳膠散射免疫比濁法檢測Lp-PLA2進行臨床應用前方法學評價與驗證，以期待選擇符合標準的試劑和方法能應用于臨床[3]。

1.對象和方法

1.1 檢測對象

本院住院人群及正常體檢人群血清。

1.2 儀器

NORMAN系列散射比濁分析儀（NORMAN-1）、NRM411全自動化學發光定量分析儀。

1.3 試劑

NORMAN脂蛋白相關性磷脂酶A2試劑盒（乳膠散射免疫比濁法）。其中R1∶200mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH7.5～9.0）﹑0.5%聚乙二醇600。R2∶200mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH7.5～9.0﹑1.9g/L膠乳和0.095g/L脂蛋白磷脂酶A2（Lp-PLA2）抗體。質控品、校準品為南京諾爾曼惠贈。

1.4 樣本采集與處理

血清用普通血清管﹑快速血清管或惰性分離膠促凝管收集。血漿用肝素鈉抗凝。樣本采集后應立即使用，若不能立即使用則2～8℃保存，在12小時內完成檢測，血清樣本在-20℃保存穩定一個月內使用。待測的樣本中不能出現沉淀，如有沉淀出現，必須先做離心處理。加熱滅活樣本﹑溶血樣本都應棄用。檢測前樣本必須恢復至室溫。冷凍保存的樣本需完全融化﹑復溫﹑混合均勻后方可使用。血清樣本切記反復凍融，血漿樣本應避免冷凍。

1.5 檢測方法

a、散射比濁法是按照試劑盒操作。加試劑R1 240ul于樣品反應杯中，然后加入血清和血漿12ul,混勻，等反應杯中的散射光強度穩定后，加入試劑R2 60ul混勻，在一分鐘之內，測定散射光強度的變化率。同時對兩個水平的質控品進行測定。b、化學發光法檢測是外送樣本至南京諾爾曼公司檢測。

1.6 統計學處理

采用SPSS16.0統計分析軟件。正態分布的計量資料以 表示，組間含量比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。非正態分布計量資料以中位數[M(P25，P75)]表示，組間及兩兩比較采用非參數秩和檢驗。評價線性和相關性時，用相關與回歸分析。符合雙變量正態分布的資料選用Spearman秩相關。偏倚分析采用Bland-Altman方法，以兩比較方法的均值作為X軸，差值作為Y軸。P＜0.05為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 選用同一家廠家化學發光法進行比對測量，使用濃度在50ng/ml～800ng/ml間12個不同濃度血清樣本進行測定比對，檢測線性范圍為100～480ng/ml，相關系數r＞0.98，相對偏差＜18%，最低檢測限＜89.2ng/ml。

2.2 干擾試驗

是在待測血清中加入一定量的膽紅素、血紅蛋白、或乳糜血中，在Lp-PLA2濃度為150 ng/ml是使得膽紅素濃度＞0.1g/L、血紅蛋白＞1.2g/L、脂血（甘油三酯）＞1.0g/L測定。記錄結果，顯示三種濃度下，結果偏差分別為8ng/ml、9ng/ml、12ng/ml，計算偏差均小于8%。

1.3 選擇20份濃度在100～480ng/ml的不同樣本，用同一批次試劑進行重復測定，計算變異系數，最高CV＜7.5%，最低CV＜2.3%。用不同批次試劑進行重復測定，每月完成1批檢測，實驗在6個月之內完成，合計6次。計算檢測值變異系數，批間差最高CV＜9.2%，最低CV＜2.8%。

3.討論

脂蛋白磷脂酶A2是臨床實驗室近期開展較多的項目，但方法學往往集中在酶聯免疫吸附試驗（ELISA）或膠乳凝集法，但方法學有一定缺陷，如時間長、定量結果不準確等[4]。乳膠散射免疫比濁法定量可廣泛應用于生化分析儀，具有方便快捷、準確等特點，因此收到臨床實驗室人員的青睞。

由結果2.1顯示該方法檢測具有較好的相關性。表明與試劑盒表明相符。結果2.1與結果2.3顯示：乳膠散射免疫比濁法線性范圍與ELISA相當，但重復性較文獻報道為好[5]。結果2.2顯示，干擾試驗與ELISA和膠乳凝集無統計學差異，偏差能夠滿足臨床需求。有結果2.3顯示，相關偏差最大小于7.5%和9.2%，小于試劑規定的8%和12%，滿足臨床需求。方法學檢測線性范圍較熒光法或化學發光法為窄，超出部分需要稀釋檢測，為該方法不足之處。[6]

綜上所述，使用脂蛋白磷脂酶A2檢測試劑盒定量測定人血清或血漿中脂蛋白磷脂酶A2（Lp-PLA2）含量的乳膠散射免疫比濁法正確度﹑靈敏度較高，可重復性及穩定性好，操作簡單快速。相應的方法學參數符合試劑盒規定的標準和要求，能夠滿足臨床需求。

[1]趙潔，吳俊，賈玫.冠心病患者血液脂蛋白相關磷脂酶A2與超敏C反應蛋白及D一二聚體的相關性研究[J].中華檢驗醫學雜志，2014，37(3):227-229.

[2]CLSI.Evaluation of precision of quantitative measurement procedures;approved guide line-third edition(EP05-A3)[S].2014.[3]張秀明，范勇利，溫冬梅，等.臨床化學自建檢測系統性能確認的精密度與正確度及準確度的研究[J].中華檢驗醫學雜志，2016，39(9):713-715.

[4]賈珂珂，秦雁飛，楊碩，等.脂蛋白（a）顆粒濃度測定方法與2種脂蛋白（a）質量濃度測定方法的比較及臨床應用評價[J].檢驗醫學，2017，32(7):570-576.

[5]李妍，曾歐，李琳，等.冠心病患者血清CysC、Lp-PLA2、MMP-9、PAI-1水平變化及臨床意義[J].山東醫藥，2016，56(33):5-7.

[6]謝海濤，湯永平，解巧麗，等.脂蛋白相關磷脂酶A2免疫熒光層析法的建立及臨床應用[J].中南醫學科學雜志，2017，45(9):523-527.