大力加強結核感染與發病機理及其實驗室診斷技術的研究

賀文從 趙雁林

近年，隨著耐藥結核分枝桿菌的產生、MTB與HIV雙重感染的增加以及流動人口的增多，全球結核病疫情呈現明顯的上升趨勢[1]。2016年，我國結核病的患者發病例數居全球當年總發病例數的第三位，僅次于印度和印度尼西亞，占全球總患者例數的10%[2]，防治形勢依舊嚴峻。而深入了解結核感染發生的條件及其演變規律對結核的有效防控至關重要。基于此，筆者從宏觀和微觀角度分別闡述了結核病的發病歷程和發病機理，以期揭示結核感染的發生、發展、傳播、轉歸，及其演變過程，為相關政策的制定和研究的開展提供依據。

著力加強結核感染與發病研究

結核病是由MTB引起的慢性呼吸道傳染病，可累及全身多個器官，以肺部受累形成肺結核最為常見。人主要通過吸入帶菌的飛沫核而引起感染，其他感染途徑如消化道、皮膚、泌尿生殖系統等均較少見[3]。易感者吸入帶菌的飛沫核后，一般宿主會通過細胞介導的免疫反應來限制MTB的增殖和擴散。少量、毒力弱的MTB多能被人體免疫防御機制所殺滅而清除，僅當受大量毒力強的MTB侵襲而機體免疫力不足時，感染后才會發病，即為原發性肺結核[4]。原發性肺結核多見于兒童，成人少見，包括原發綜合征和胸內淋巴結結核。原發綜合征的肺部原發灶好發于上葉下部和下葉上部。初次感染MTB時，由于早期特異性免疫力尚未形成，MTB沿引流淋巴管侵入肺門淋巴結，甚至有早期菌血癥，形成播散病灶在其他臟器潛伏下來，成為日后肺外結核病的來源[5]。大多數肺部原發病灶、淋巴管炎和淋巴結炎癥狀較輕并可自愈，少數由于機體免疫力明顯低下或MTB毒力強、數量大及機體劇烈變態反應，發展為原發性肺結核。臨床表現為發熱、盜汗、咳嗽、食欲不振、體質量減輕等慢性消耗性疾病特征[5]。

結核病的許多癥狀是宿主的免疫反應導致的，而非MTB的直接毒性作用。從臨床癥狀可以得到如下結論，MTB成功感染需要3個階段[6]：(1)在巨噬細胞中成功繁殖；(2)MTB能夠修飾宿主的免疫反應，使宿主能夠控制但不能根除細菌；(3)能夠在宿主中相對不活躍的持續存在而保留被激活的潛力。過去研究普遍認為，MTB一旦進入下呼吸道被肺泡巨噬細胞吞噬后，就會不可避免地形成“一旦感染，終生攜帶”的慢性感染結局[7]。而Ewer等[8]研究表明，在早期感染階段，少部分人群可清除MTB，只有不到10%的感染者在初次感染后會出現明顯的臨床癥狀，而大多數人都可以通過細胞介導的免疫反應形成肉芽腫將感染局限化。MTB侵入人體后 4～8 周，身體組織對MTB及其代謝產物發生遲發型變態反應，局部出現炎性滲出，甚至干酪樣壞死，常伴有發熱、乏力及食欲減退等全身癥狀，此時結核菌素皮膚試驗(TST)可呈陽性反應[6]。在該生理狀態下殘留的少量MTB就形成了潛伏結核感染(latent tuberculosis infection, LTBI)狀態。潛伏感染者無明顯結核病的臨床癥狀體征，亦不會引起結核病的傳播流行，但流行病學研究表明，潛伏感染者是活動性結核病發生的主要來源[9]。其高危人群主要包括HIV感染者、接受免疫抑制治療的患者以及患有慢性系統性疾病患者，包括終末期腎病、風濕性疾病、糖尿病等[10]。

目前研究表明結核病的發生可大致分為兩個階段[10]，第一階段是LTBI，即MTB感染人體，不產生臨床癥狀和體征，一般通過TST和(或)γ-干擾素釋放試驗(IGRA)進行診斷；第二階段是大約 10% 的LTBI患者會發展成活動性結核病，在HIV感染者中該比率可高達10%～15%[11]，具體表現為MTB的痰培養或抗酸桿菌(AFB) 涂片陽性，胸片特征性表現和結核病癥狀如持續咳痰、發熱、體質量下降等。活動性結核病臨床癥狀和影像學特征明顯，且具有較強的傳播能力，健康者可吸入其咳嗽或噴嚏的飛沫而引發新一輪的結核感染和流行。

作為以飛沫核傳播為主的肺結核，MTB以氣溶膠的形式進入肺泡后，巨噬細胞和樹突狀細胞可以分別通過固有吞噬受體和模式識別受體 (PRRs) 來識別MTB，進而刺激宿主的免疫應答[12]。經處理的結核抗原由主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ處理呈遞給CD4+T細胞，由MHCⅠ呈遞給CD8+T細胞, 以啟動適應性免疫應答[7]。活化 CD4+T 細胞是根據細胞因子分泌的不同被分成不同的功能亞群， 如 輔助性(Th)1、Th17、Th2 和調節性T 細胞 (Treg)。 活化 CD8+T 細胞成為細胞毒性 T 淋巴細胞 (CTLs) 通過顆粒胞吐作用和凋亡殺死感染細胞。免疫高峰期過后，大多數活化效應 T細胞凋亡, 只有少數發展成記憶 T 細胞 (Tm)[7]。以兔為模型的研究表明，MTB感染的嚴重性與帶菌的顆粒大小呈現負相關[13]，小的顆粒可以深入肺下部；在肺上部，一些共生菌已經表達的病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)通過Toll樣受體信號(Toll-like receptor, TLR)通路招募巨噬細胞等固有免疫細胞，可以清除MTB。而在肺下部，PAMPs會被MTB表面的巰基乙酸二甲酯(phthiocerol dimycocerosates，PDIM)封鎖而不能發揮機體的清除作用，使MTB更易感染人體而致病[12]。感染期間，MTB首先感染抗原提呈細胞，包括巨噬細胞和樹突狀細胞。MTB可以表達酚糖脂，誘導其表面產生CCL2，因此可以招募和感染更多的依賴細胞表面趨化因子受體2(CCR2)的巨噬細胞和淋巴細胞，進一步形成結核感染的標志性病理結構——結核肉芽腫[12]。肉芽腫中心聚集有大量的中性粒細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)和大量的CD4+T細胞以及少量的CD8+T細胞，大量成纖維細胞聚集在外圍[14]。大多數感染的人都存在肉芽腫的潛伏狀態, 而一些可能發展成活動性肺結核與播散性肉芽腫。近期以斑馬魚為感染模型的研究發現，肉芽腫可以為MTB提供更多的氧氣和營養來源，有利于其生長復制。在以鼠為模型的研究發現，結核肉芽腫起始于樹突狀細胞，然后招募巨噬細胞和中性粒細胞，該過程發生于適應性免疫啟動之前。在有些動物模型中發現，結核肉芽腫內部嚴重缺氧，該現象與人體肉芽腫情況相一致，常因營養或氧缺乏而形成中心干酪樣壞死[15]。

在人體內，MTB 差異區域(region of diffe-rence-1, RD-1)編碼Ⅶ型分泌系統(type Ⅶ secretion system，T7SS；或稱ESX分泌系統)-1刺激宿主表達基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase 9, MMP-9)以吸引巨噬細胞到感染部位形成肉芽腫[16]。招募的巨噬細胞吞噬入侵的MTB，并分泌促炎細胞因子和趨化因子，然后中性粒細胞聚集到該部位，通過還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶依賴機制殺滅MTB[17]。當中性粒細胞清理失敗時，巨噬細胞會將MTB內化處理，進一步激活T細胞、NK細胞等。淋巴結引流區的樹突狀細胞也會激活CD4+T細胞和CD8+T細胞。CD4+T細胞是被招募最快的主要細胞類型，它們圍繞在由巨噬細胞和抗原提呈細胞聚集形成的結核性肉芽腫中心。部分CD8+T細胞也被招募到肉芽腫的周圍，最外面是由成纖維細胞和其他的細胞外基質成分組成[18]。

結核性肉芽腫通常被認為是對宿主的一種保護機制，因其將MTB局限化，使其不能感染鄰近組織，當宿主可以成功控制感染時，肉芽腫會脫水鈣化[19]。在大多數患者中，MTB會在與宿主的抗爭過程中達到一種平衡狀態，即為潛伏感染。這種潛伏感染狀態是不穩定的，可以被HIV感染、寄生蟲感染等外源性感染或者營養不良等免疫功能不足激活。在這種情況下，MTB會迅速繁殖，引起肉芽腫崩裂，使病原菌得以在體內播散。有研究表明，肉芽腫實際上由MTB誘導形成，并有利于病原體的擴散[20]，因為肉芽腫誘導形成的血管可以為MTB提供生長復制的氧氣和營養。肉芽腫的形成是病原體和宿主相互作用的動態過程，肉芽腫在結核病的發生、發展和轉歸過程中扮演了雙重角色。從一定程度上講，肉芽腫的發展和轉歸決定著結核病的病程和感染的最終結果[20]。

結核病是由MTB感染后引發的宿主慢性肉芽腫及其延續的免疫反應所介導的。MTB的感染可能導致不同的感染結果，但究竟何種因素決定了MTB感染結果還不得而知。在恒河猴感染模型中，多個基因型的MTB混合后感染同一宿主，不同的結核病灶常常由不同基因型的細菌誘導形成。即使是同一個菌株感染同一個宿主，在肺臟的不同部位的感染結果也不盡相同。目前的研究結果認為，感染結果與感染部位的微環境尤其是適應性免疫應答的殺傷速度相關[21]，MTB成功感染機體，形成的肉芽腫內部也具有各自不同的微環境和免疫平衡，從而最終決定了感染狀態和疾病走向。據此可知，基于免疫微環境的研究，勢必利于更好地了解MTB感染的最終結局和免疫機制的相關性，為靶向化療藥物的開發研制奠定理論基礎。

努力提高結核病診斷與預后判斷的研究

結核病患者的發現方式主要分為被動發現和主動發現。被動發現是指患者出現結核可疑癥狀后主動到相關醫療機構就診，此為一項經常性的患者發現手段。主動發現主要是指衛生主管部門醫療保健單位組織針對人群開展的與肺結核有關的醫學檢查，包括普查和重點人群檢查。由于普查的成本-效益較低，一般多采用重點人群篩查。重點人群主要包括肺結核患者的密切接觸者、糖尿病患者、既往結核病患者、腫瘤患者、HIV感染者以及疑似肺結核癥狀者等。在結核潛伏感染階段，患者無明顯臨床癥狀和體征，臨床多通過TST和(或)IGRA進行診斷，當發展為活動性結核病時，可表現為痰AFB涂片和培養陽性，胸片特征樣改變，以及諸如咳嗽、咳痰、低熱、盜汗、體質量下降等臨床表現。

結核病的實驗室診斷方法主要包括細菌學、免疫學、分子生物學檢查。傳統的細菌學診斷主要通過痰涂片染色鏡檢和培養，但涂片鏡檢的敏感度低，導致該方法的臨床漏診率較高。李強等[22]研究發現抗酸桿菌自動熒光染色和顯微鏡掃描技術在檢測MTB的敏感度和特異度較高，可作為傳統的涂片鏡檢檢測的替代工具。在診斷中一貫作為金標準的痰培養也因前處理繁瑣、培養耗時長、易污染等因素常延誤結核病的診斷和治療。隨著分子生物學的發展，以核酸擴增為基礎的檢測方法相繼建立，如：美國Cepheid公司開發的集痰標本處理、DNA提取、核酸擴增、利福平耐藥rpoB基因突變檢測為一體的全自動分子診斷方法，GeneXpert MTB/RIF具有較高的敏感度和特異度[23]。金法祥等[24]研究以MGIT 960 液體培養作為診斷的金標準證實了GeneXpert MTB/RIF臨床應用及推廣價值。環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)使用多個特異引物和一個鏈置換酶實現PCR反應在恒溫條件下快速進行，大大提高試驗效率和降低實驗室成本[25-26]；實時熒光恒溫擴增(simultaneous amplification and testing，SAT)將新一代恒溫擴增與實時熒光檢測技術相結合，可準確鑒定MTB與非結核分枝桿菌，聶曉平等[27]評估了該技術對肺外結核病的臨床診斷價值，發現SAT具有操作方便快速、檢出率高、敏感度和特異度均較高的優勢。但該技術也存在微量污染、假陽性等問題，因此，應嚴格操作規范、減少假陽性產生[28]。免疫學檢測方法主要有結核菌素試驗(PPD)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)等。由于受接種卡介苗的影響，PPD試驗的特異度較低；ELISA主要用于檢測血清中的特異性抗體，由于分枝桿菌種屬間存在共同抗原決定簇以及抗原性較弱等原因，該方法的敏感度和特異度偏低[29]，但有研究發現基于MTB特異性分泌蛋白MPB64建立的ELISA方法具有高敏感度[30]；T-SPOT.TB 是由酶聯免疫斑點技術發展而來，通過檢測γ-干擾素水平，判斷是否具有針對MTB特異性的T細胞反應，其敏感度和特異度較高，但存在結果易受到干擾、操作復雜、耗材相對昂貴等缺陷[31]。劉浩然等[32]研究發現通過檢測胸腔積液中巨噬細胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)水平對肺結核和肺癌有一定的鑒別診斷作用。目前，實驗室檢查可采用多種檢測方法聯合應用，以期達到優勢互補、提高檢出率的目的。

注重循證決策，不斷深入開展對結核病防治重點及難點問題的研究

近年耐多藥結核(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)和廣泛耐藥結核(extensively drug-resistant tuberculosis, XDR-TB)的出現以及HIV與MTB雙重感染給結核病的預防與控制工作帶來了巨大的挑戰[23, 33]。其中，治療方案不合理、患者依從性差以及宿主免疫損害增多等因素是導致耐藥結核病產生的主要原因[34]，當然，原發性耐藥MTB菌株的傳播也是不容忽視的重要原因[35]。耐藥結核病病程長、死亡危險大、傳染期長，增加了耐藥結核病傳播的機會，并使總體人群暴露于耐藥MTB的危險之中。同時，HIV與MTB雙重感染是艾滋病及結核病防治工作的重點，結核病是HIV感染者最常見的機會性感染和主要死因之一，兩者感染的發生密切相關[33]。HIV的感染一方面加快了MTB感染者發展為活動性肺結核患者的進程，另一方面，HIV感染破壞了患者機體的免疫系統，致使機體對MTB的抗原應答能力嚴重受限，增加了機體對MTB的易感性，也加大了結核病內源性復燃或外源性再感染的風險。此外，一旦結核病患者感染了HIV，也會使結核病病情迅速發展，兩者互相促進，加速病情惡化[11]。

MTB與宿主的相互作用是一個動態的演化過程，結核感染的進程和最終結局與宿主和病原體的因素均密切相關。此外，結核病是一種古老的疾病，在長期的與人類抗結核感染的斗爭中，也不斷發生著基因的演變和進化，進而出現了MDR-TB和XDR-TB ，給結核病的防控工作帶來巨大挑戰。目前，結核病完全防治的實現仍是一個世界性的醫療難題。其防控工作不僅要注重對結核病診斷和治療，更要加強對結核病防治的科學研究。將宿主、病原菌以及環境3個要素有機結合起來，充分融合當代先進分子生物學技術，加強國內外戰略資源共享，同時注重對結核病疫苗、診斷和治療藥物的研究，從三級預防策略著手，以期達到科學、高效防控結核病，為實現2035年終止結核病流行的戰略目標做貢獻。