非洲豬瘟流行現狀分析及診斷方法研究進展

祖立闖，李 嬌，謝金文，李 峰，沈志強，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600）

非洲豬瘟（African swine fever,ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，臨床上以豬高熱、食欲廢絕、皮膚發紺、內臟實質器官出血、呼吸系統和神經系統功能紊亂為主要特征，被世界動物衛生組織（OIE）列為必須報告的動物疫病，在我國被列為一類動物疫病[1-3]。該病病程極短、死亡率極高，已對發病國家的養豬業造成了災難性的打擊[4-5]，2018年7月末，遼寧省沈陽市發生首例非洲豬瘟疫情[6]，非洲豬瘟對我國養豬業的危害與日劇增。本文分析了ASF流行現狀，并對我國研究學者在ASF各種診斷技術方面取得的研究進展進行了綜述，對加強我國ASF診斷技術的儲備以及制定ASF防控措施均具有一定的參考價值。

1 非洲豬瘟流行現狀分析

ASFV是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，病毒基因組全長170～190 kb，為有囊膜的雙股線狀DNA病毒，病毒粒子大小為175～215 nm，呈正二十面體結構[2，5]。該病毒可使各種日齡和品種的家豬與野豬感染并發病，病毒可在多數蜱種中增殖，使蜱成為病毒的貯藏宿主和主要傳播媒介[7]。該病毒最早于1921年在非洲東部肯尼亞首次被發現，隨后開始在撒哈拉以南的非洲東部、中部、南部等地區蔓延。1957年病毒從非洲的安哥拉傳到歐洲的西班牙，病毒開始在歐洲呈零星、持續流行。1971年病毒從西班牙傳入南美洲的古巴，南美洲和拉丁美洲的多數國家陸續暴發疫情。2007年病毒傳入歐亞接壤的高加索地區，隨后開始向俄羅斯南部地區擴散流行，2017年傳播至俄羅斯遠東地區伊爾庫茨克，導致傳入我國的風險空前升高。2018年7月末，遼寧省沈陽市一養豬戶飼養的豬陸續發生不明原因死亡，病死豬剖檢發現脾臟異常腫大，疑似非洲豬瘟病毒感染，經國家外來動物疫病研究中心檢測，確診為非洲豬瘟病毒核酸陽性，通過序列分析發現引起該疫情的非洲豬瘟病毒B646L/p72基因序列與俄羅斯毒株100%匹配，與俄羅斯和東歐目前流行的格魯吉亞毒株（Georgia 2007）屬于同一進化分支[6]，這是我國發現的首例非洲豬瘟，我國政府通過采取疫點和疫區內所有生豬撲殺措施，疫情得到了有效控制。

2 非洲豬瘟病毒的診斷方法

2.1 PCR方法

PCR方法操作簡單、檢測快速，是目前最簡單的分子生物學檢測技術，但該方法的敏感性有限，且擴增后電泳檢測需要使用溴化乙錠。吳憶春[8]通過人工合成ASFV VP73基因中保守性較強的基因片段，將其克隆入pET-32a載體，構建重組質粒pETVP73，再根據GenBank中公布的ASFV的VP73基因序列設計特異性引物，以重組質粒為模板，優化PCR擴增條件，建立了檢測ASFV的PCR方法，并組裝了PCR檢測試劑盒。該PCR試劑盒可特異性擴增出429 bp的ASFV VP73基因片段，檢測豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬圓環病毒2型（PCV2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬乙型腦炎病毒（JEV）、豬細小病毒（PPV）、健康豬和蜱的基因組均為陰性，試劑盒的敏感性可達0.1 fg，試劑盒批內和批間的重復性檢測結果無明顯差異，試劑盒分別置于4℃和-20℃條件下保存12個月后穩定性無明顯改變。該ASFV PCR檢測試劑盒為我國ASFV的快速診斷及流行病學監測提供了重要的技術儲備。楊吉飛等[9]建立的ASFV PCR檢測方法檢測 PPV、PCV2、PRV、口蹄疫病毒（FMDV）、CSFV、PRRSV、豬水皰病病毒（SVDV）、副豬嗜血桿菌、豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌、豬衣原體、健康豬、蜱均為陰性，能夠檢測到0.2 fg的重組質粒核酸，檢測西班牙食品與農業技術研究院動物健康研究中心和歐盟非洲豬瘟參考實驗室饋贈的17個ASFV毒株均為陽性，檢測國內收集的50份豬和30份蜱的野外樣品基因組均為陰性。該PCR檢測方法具有很好的應用性，可以有效地應用于ASF的診斷以及防控。

2.2 納米PCR方法

納米PCR技術是一種新型的PCR技術，將固體納米金屬顆粒懸浮在液體里形成納米流體，由于納米流體熱導性強，使PCR體系能夠更快地達到目標溫度，減少在非目標溫度的停留時間，在提高PCR反應特異性的同時增加了特異性擴增產物的產量，使納米PCR檢測的敏感性大幅提高，但納米PCR方法擴增后仍然需要使用溴化乙錠進行電泳檢測。崔尚金等[10]采用納米金顆粒作為熱導介子，建立了ASFV的高效納米PCR檢測方法，該方法檢測大腸桿菌、PRV、PCV2、CSFV、PRRSV、豬捷申病毒（PTV）、豬腦心肌炎病毒（EMSV）均為陰性，敏感性是常規PCR檢測方法的1 000倍，其最低核酸拷貝數檢出量可以達到10個拷貝，該方法對黑龍江、吉林和河南3個省份的8個地區臨床送檢的69份樣品進行檢測，結果均為陰性，表明以上3個地區均未發現ASFV感染情況，納米PCR檢測方法為ASFV的診斷提供了新技術。

2.3 熒光定量PCR方法

實時熒光定量PCR方法是將光譜技術引入到PCR反應中，通過熒光信號的強弱變化定量測定特異性擴增產物的量，解決了常規PCR方法敏感性低和電泳檢測中溴化乙錠對環境的污染問題。李洪利等[11]根據GenBank中23株編碼ASFV結構蛋白p72的基因序列，設計引物和探針，優化退火溫度、Mg2+濃度、引物和探針濃度，建立了檢測ASFV的實時熒光定量PCR方法，該方法重復性試驗變異系數小于1.3%，敏感性試驗最低能夠檢測到10拷貝/μL 的質粒，檢測 CSFV、PRRSV、PCV2、PRV、PPV等5種豬病病毒均為陰性，表明實時熒光定量PCR方法是一種能夠快速、靈敏、特異地檢測ASFV的方法。王建華等[12]根據ASFV CP530R基因序列設計1對特異性引物和探針，通過優化反應條件，建立了檢測ASFV的TaqMan-MGB探針實時熒光PCR方法，該方法僅對ASFV發生特異性擴增反應，不與 PRV、PPV、PCV2、CSFV、PRRSV、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬流感病毒（SIV）發生交叉反應，該方法最低可檢測到61個拷貝的質粒標準對照分子，該方法4次重復性檢測的變異系數均小于2.0%，應用該方法對126份進口豬的血液樣品和38份豬肉樣品進行ASFV檢測，結果均為陰性。熒光定量PCR方法敏感性高、特異性強，將逐步成為ASFV的臨床診斷、檢疫、食品安全檢驗的重要方法。

2.4 等溫擴增方法

等溫擴增方法是一種新興的分子生物學檢測方法，等溫擴增方法不需要PCR中的變性、退火步驟即可完成對靶序列的循環擴增，大幅縮短了時間，整個擴增反應時間一般少于60 min，而常規PCR方法的反應時間一般需要2 h以上，且使反應能夠在恒溫條件下進行，對儀器設備要求低，不需要昂貴的儀器設備，一臺水浴鍋即可完成擴增反應。等溫擴增方法非常適合于ASFV的現場快速診斷，但等溫擴增方法的靈敏度較高，易導致假陽性的擴增結果。目前，ASFV的等溫擴增技術主要有環介導等溫擴增（LAMP）和重組酶聚合酶等溫擴增（RPA）兩種。王華等[13]通過對ASFV p72蛋白基因序列進行分析，根據p72保守區序列設計合成了內、外2對引物，通過對反應條件進行優化，建立了檢測ASFV的LAMP方法，該方法在62℃保溫60 min即可完成，最低可檢測到1×101拷貝/μL的病毒DNA，比常規PCR方法的靈敏度高100倍。對ASFV、PCV2、PPV、PRV基因組DNA同時檢測，結果僅有ASFV出現條帶，而其他均未出現目的條帶。表明ASFV-LAMP診斷方法具有較好的特異性、敏感性和臨床適用性。王建昌等[14]基于ASFV p72基因保守序列，設計并合成引物，建立了檢測ASFV的RPA方法，該方法在38℃水浴鍋中恒溫反應30 min即可實現對目的片段的有效擴增，僅特異性擴增 ASFV p72基因，對 FMDV、CSFV、PRRSV、PRV、PCV2均沒有擴增，對p72重組質粒檢測的限達到102拷貝。RPA方法操作簡單、反應快速、檢測成本低、結果確實可靠，為ASF的一線防控提供了一種新的、可靠的技術支持。

2.5 ELISA方法

ELISA方法高通量、檢測快速、操作簡單，是目前常用的免疫學診斷技術，可用于豬群中ASFV感染的大規模調查，但作為血清學檢測技術，該方法具有一定的滯后性，無法對ASFV的早期感染做出診斷。梁云浩等[15]利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統表達出ASFV P54蛋白，經SDS-PAGE分析顯示重組蛋白的大小約為25 ku，Western-blot試驗證實重組蛋白具有良好的抗原性，以P54重組蛋白作為檢測抗原包被酶標板，通過優化各反應條件，建立了檢測ASFV血清抗體的間接ELISA方法，該方法檢測CSFV、PRRSV、FMDV、SIV、PRV、豬肺疫、豬丹毒陽性血清均為陰性，檢測靈敏度可達1∶320，批內、批間變異系數均小于10%，具有敏感性高、重復性好、特異性強、準確性高等特點。靳雯雯等[16]利用原核系統表達的VP73蛋白作為包被抗原，建立了檢測ASFV抗體的間接ELISA方法，該方法對ASFV陽性血清的檢測靈敏度可以達到1∶2 560，檢測豬傳染性胸膜肺炎、CSFV、PRV、FMDV、PRRSV 陽性血清均為陰性，批內和批間重復性試驗的變異系數均小于10%，包被好的酶標板37℃放置5 d后檢測的敏感性無明顯變化，相對于進口ELISA試劑盒的特異性和敏感性分別為99.1%和94.3%，符合率為98.0%，具有良好的特異性、敏感性、重復性、穩定性，可以滿足臨床ASF抗體檢測的需求。

2.6 膠體金試紙檢測方法

膠體金試紙檢測方法是以膠體金作為示蹤標志物，利用層析技術實現抗原抗體特異性檢測的一種新型的免疫檢測技術。該方法具有快速、靈敏、特異等優點，尤其適合臨床的快速診斷，但該方法的敏感性較高，易出現假陽性。張鑫宇等[17]利用原核表達系統表達了ASFV p54重組蛋白，利用His親和層析成功純化了p54蛋白，將純化蛋白利用膠體金標記后噴涂于玻璃纖維墊，分別以葡萄球菌A蛋白（SPA）和抗p54多克隆抗體作為檢測線和質控線，制備了檢測ASFV p54抗體的膠體金免疫層析試紙，該試紙條的敏感性為200 ng/mL，檢測 CSFV、PRV、PRRSV、PPV、PCV2 陽性血清均為陰性，采用該膠體金試紙條和ELISA方法檢測24份ASFV弱毒免疫后第13天的豬血清樣品（由英國Pirbright研究所OIE ASF參考實驗室提供），膠體金試紙條的檢出陽性率為100%，而ELISA檢出陽性率為33.3%。ASFV抗體免疫層析檢測方法具有特異性強、敏感性高等特點，在5～10 min內可以判定結果，適合臨床ASF的血清學快速診斷和流行病學調查，在ASF防控中具有良好的應用前景。

3 結語

在我國的《國家中長期動物疫病防治規劃（2012—2020）》中，ASF被列為優先防范的13種重大外來動物疫病之一，且我國已發生首例ASF疫情，該病一旦在我國廣泛流行，將給我國養豬業及養豬相關產業造成巨大沖擊。目前應加強流行病學調查和主動監測排查工作，保持高度警惕，防止該病在我國的進一步流行。本文通過綜述我國研究學者在ASF各種診斷技術方面取得的研究進展以及各種診斷方法的優缺點，為開發具有我國自主知識產權的ASFV診斷技術和診斷試劑盒奠定了基礎，為我國防控ASFV提供了技術儲備。相信隨著國家對ASF疫情的不斷重視與嚴防嚴控力度的不斷加強，研究學者對ASF診斷技術研究的不斷完善，我國必將能控制和消滅ASFV在我國的流行。