紫草油對肛瘺術后組織修復及TGF—β1和Smad3表達的影響

趙誠 王未娟

[摘要]目的 通過研究肛瘺術后TGF-β1和Smad3因子的表達變化，了解紫草油促進創面愈合的機制。方法 選取2017年3月～2018年3月我院收治的90例肛瘺患者作為研究對象，按照簡單隨機方法分為紫草油組（30例）、膚痔清組（30例）與凡士林組（30例）。紫草油組采用紫草油外用方法，膚痔清組采用膚痔清外用，凡士林組采用凡士林外用。利用RT-PCR 和Western-blot檢測比較三組的TGF-β1和Smad3因子的表達情況。結果 RT-PCR 和Western-blot表明，紫草油組TGF-β1含量逐漸升高。治療后第21天，紫草油組中TGF-β1含量高于膚痔清及凡士林組，差異有統計學意義（P<0.05）；治療后第21天，紫草油組中Smad3含量低于膚痔清及凡士林組，差異有統計學意義（P<0.05）；同時紫草油組的愈合時間也短于其他兩組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 紫草油能夠有效促進肛瘺術后創面愈合，可能是通過上調TGF-β1含量及下調Smad3含量來調控的。可為紫草油治療濕熱下注型肛瘺術后提供了初步的理論基礎。

[關鍵詞]肛瘺；紫草油；TGF-β1；Smad3

[中圖分類號] R657.1+6 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）10（a）-0004-05

[Abstract] Objective To explore the mechanism of Arnebia Root Oil promoting wound healing by studying the expression changes of TGF-β1 and Smad3 factors after anal fistula surgery. Methods A total of 90 anal fistula patients admitted to our hospital from March 2017 to March 2018 were enrolled in this study. They were divided into the Arnebia Root Oil group （n=30）， Fuzhiqing group （n=30） and Vaseline group （n=30） according to the simple random method. In the Arnebia Root Oil group， Arnebia Root Oil was used， while in the Fuzhiqing group， Fuzhiqing for external application was used， and in the Vaseline group， Vaseline for external application was adopted. Expression of TGF-β1 and Smad3 factors among three groups was compared and detected by reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） and Western blot. Results RT-PCR and Western blot showed that the content of TGF-β1 in the Arnebia Root Oil group increased gradually. On the 21st day after treatment， the content of TGF-β1 in the Arnebia Root Oil group was higher than that in the Fuzhiqing and Vaseline groups with statistical significances （P<0.05）. On the 21st day after treatment， the content of Smad3 in the Arnebia Root Oil group was lower than that in the Fuzhiqing and Vaseline groups， which differed statistically （P<0.05）. Meanwhile， the healing time in the Arnebia Root Oil group was shorter compared with that of the other two groups （P<0.05）. Conclusion Arnebia Root Oil can effectively promote wound healing after anal fistula surgery， which may be regulated by TGF-β1 up-regulation and Smad3 down-regulation， thus providing a preliminary theoretical basis for Arnebia Root Oil treatment after anal fistula surgery identified as a damp-heat pouring downward pattern.

[Key words] Anal fistula； Arnebia Root Oil； TGF-β1； Smad3

肛瘺是肛管直腸與肛門周圍皮膚相連通的一種病理通道，是肛周膿腫的慢化階段，其臨床表現特點主要為肛門硬結、壓痛、反復局部流膿、潮濕及瘙癢。紫草油多年臨床驗證它能促進創面愈合，然其作用機制不明。TGF-β1/Smad3信號轉導通路在創面修復過程扮演著重要的角色。所以為闡明紫草油的作用機制，本實驗以TGF-β1和Smad3因子為研究對象，檢測TGF-β1和Smad3 因子表達水平的變化。

1資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2017年3月～2018年3月收治的90例肛瘺患者作為研究對象，均簽署知情同意書。本研究已經醫院醫學倫理委員會審核批準。按照簡單隨機方法分為紫草油組（30例）、膚痔清組（30例）與凡士林組（30例）。紫草油組中，男19例，女11例；平均年齡（45.22±11.01）歲。膚痔清組中，男17例，女13例；平均年齡（43.02±10.21）歲。凡士林組中，男18例，女12例；平均年齡（44.62±09.51）歲。三組的性別、年齡等一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性

1.2 診斷及入選標準

按照2006年出版的《肛瘺臨床診治指南（2006版）》[1]，選取低位單純性肛瘺作為研究對象。所有病例均在局麻下行“肛瘺切開術”。

1.3研究方法

1.3.1 血清的提取 各實驗組于手術后第1、7、14、21天次日抽取外周靜脈血3～5 ml，離心機離心后吸取上層血清至1.5 ml EP管保存。

1.3.2 RT-PCR法 按試劑盒操作程序提取總RNA并檢測，之后進行RT-PCR實驗。目的基因引物： TGF-β1上游引物序列為5′-AAGGACCTGGGTTGGAAGTG-3′，下游引物序列為5′-CCGCTTCCTTTGTCCATCAG -3′（擴增產物長度：381 bp）。Smad3基因的上游引物序列為5′-AGTTTGACGGTGAGCTGGTA-3′，下游引物序列為5′-GCCTCGGCCTGCCGCAAGCCT-3′（擴增產物長度：364 bp）。內參GAPDH序列為：上游5′-CACCGGGAAACCCATCACCA-3′，下游為5′- ACGCC AGTAGACTCCACGACAT -3′（擴增產物長度：96 bp）。PCR產物在2%瓊脂糖凝膠電泳，GoldViewTM染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。

1.3.3 Western-blot法 裂解液提取總蛋白后取等量總蛋白。電泳分離后用PVDF膜進行轉膜。將TGF-β1和Smad3一抗用封閉液稀釋1000倍；將封閉后的膜直接放入一抗工作液中，4℃反應過夜。然后將二抗用1×TBST稀釋3000倍，將一抗反應膜放入二抗中作用60 min。ECL試劑盒顯色，拍照，采用美國UVP分析儀器，對膠片進行掃描，比較各組灰度變化

1.4統計學方法

采用SPSS 21.0統計軟件對數據進行分析處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩樣本之間采用t檢驗，多樣本比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 TGF-β1和Smad3 mRNA在血清中的表達

TGF-β1 及Smad3 PCR擴增曲線顯示，每條曲線均有明顯的指數擴增期，表明PCR體系完好；TGF-β1 及Smad3 PCR產物的溶解曲線顯示各擴增產物為特異性目的基因（圖1～2）。

2.2三組術后不同時間TGF-β1和Smad3 mRNA相對表達水平的比較

經治療，肛瘺術后三組TGF-β1 mRNA的表達水平均有所升高。術后第21天紫草油組中的TGF-β1 mRNA表達高于凡士林組、膚痔清膏組，差異有統計學意義（P<0.05）；同時術后第21天，紫草油組中的Smad3 mRNA表達低于凡士林組、膚痔清膏組，差異有統計學意義（P<0.05）（表1）。

2.3紫草油治療肛瘺術后TGF-β1、Smad3 蛋白表達水平的影響

術后第21天，紫草油組TGF-β1蛋白表達水平明顯高于凡士林組、膚痔清組，差異有統計學意義（P<0.05）。與之相反，Smad3 蛋白表達水平明顯低于凡士林組、膚痔清組，差異有統計學意義（P<0.05）（圖3、表2）。

2.4三組病例創面愈合時間的比較

紫草油組的創面愈合時間短于膚痔清組及凡士林組，差異有統計學意義（P<0.05）（表3）。

3討論

肛瘺是肛腸科常見疾病。肛瘺亦稱為肛管直腸瘺，是一種異常管道[2]。國外有學者[3]報道，每十萬人口有86人罹患肛瘺，平均年齡38.3歲，男女比例為1.8∶1.0，年齡<15歲的患者多為男性。手術是肛瘺的主要治療方法，但由于特殊的病變部位，肛瘺術后一般不做縫合，創面大，容易感染，創面愈合緩慢，因此如何加快肛瘺術后創面修復就成為臨床研究的熱點[4-5]。中醫外治是最古老的治法之一，尤其對肛腸疾病，中藥制劑的外用能使藥性直達病所，比內服更具有優勢，故《醫說源流》曰：“外科之證，最重外治”。肛門局部創面分泌物稠厚黃白等“濕”“熱”的特點。除此之外，肛瘺術后，經脈受損，施術局部氣血阻滯，與濕熱相結，形成濕熱蘊結，氣滯血瘀的病理狀態，采用清熱利濕、活血化瘀、消腫止痛之中藥，使濕熱除，瘀血去，新血生，瘡瘍愈合。故如何運用清熱利濕化瘀法于肛瘺術后關重要。

祖國醫學認為通過中藥外用，能夠加速創面愈合，療效明確。主要因為通過中藥外用能促進組織周圍的細胞釋放相關生長因子，導致創面氧自由基的量和活性降低，進一步提高機體抗感染能力[6]。我院紫草油方以紫草為君，黃連為佐使。紫草味苦、甘，性寒。功效：活血、涼血、解毒透疹。《本草綱目》曰：“紫草，其功長于涼血活血，利大小腸。”紫草外用常調制成油膏，亦可以水濃煎用。治療癰疽腫毒多用于潰后，或用于各種慢性潰瘍，凡創面赤腫及滲出較多者用之可起清熱消腫、減少滲出之功效，從而可生肌長肉，促進潰瘍愈合。黃連味苦性寒，有清熱、瀉火解毒的功效。常用于濕熱證等，又解毒療瘡.以治癰疽腫毒.口舌生瘡等。二味共為君藥共奏清熱利濕、消腫止痛之功。

創面愈合就是一個復雜的修復過程，機體通過自身的再生能力，恢復創面表面的連續性和完整性。在這個復雜的生物學過程中，涉及多種組織和修復細胞、生長因子、細胞因子和胞外基質成分以及各種調控因素的共同參與。肉芽的主要成分是新生的毛細血管床和成纖維細胞[7]。創面愈合的主要修復細胞為成纖維細胞，直接影響膠原合成和分泌，而合成的膠原又是構成細胞外基質的主要部。研究也證實，TGF-β1/Smad 信號通路的調控作用與創面愈合是密不可分的[8]。

TGF-β1是創面修復過程中重要的細胞因子，TGF-β/Smad 信號通路重要的組成部分[9]。TGF-β1作為 TGF-β 細胞因子家族的一員，與創傷愈合緊密聯系[10-11]。TGF-β1不僅是成纖維細胞的強效趨化因子，也是一種抗炎細胞因子[12]。主要作用于炎癥及修復細胞，可產生細胞的趨化性遷移、抗炎等生物學效應[13]。此外TGF-β是刺激創面肉芽組織形成最有效的細胞因子之一，而這一誘生過程是可逆的，可增加傷口組織抗張強度和促使血管新生，對表皮有明顯促進愈合作用。相關研究[14]提示，TGF-β1/Smad 信號通路對血管正常結構的維持有重要的作用。本實驗研究中表明，三組藥物干預均能上調TGF-β1 mRNA及蛋白的表達，但術后第21天紫草油組中的TGF-β1 mRNA及蛋白表達明顯高于凡士林組、膚痔清膏組，差異有統計學意義（P<0.05），提示紫草油能有效促進肛瘺術后創面的愈合，與紫草油外用作用于創面后上調TGF-β1 mRNA有密切的關系。

Smad蛋白家族是細胞內重要的信號轉導蛋白，直接參與TGF-β超家族成員TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3以及骨形態發生蛋白（BMP）等多個成員的信號傳導[15]。Smad2與Smad3 屬于共同介導性的Smad蛋白，是TGF-β1信號轉導通路中特異的、起瓶頸作用的重要因子。然而真正反映TGF-β1/Smad3信號通路的激活水平與強度的是磷酸化Smad3 表達水平[16-17]。因此相關研究表明提高磷酸化 Smad2、Smad3 表達水平，可激活潰瘍創面 TGF-β1/Smad3 信號通路，加速傷口的修復[18]。相關研究表明敲除Smad3后，促使Smad3 表達降低，創傷愈合明顯加速[19]。本實驗研究中表明，三組藥物干預后Smad3表達逐漸下降。術后第21天紫草油組中的Smad3 mRNA及蛋白表達明顯低于凡士林組、膚痔清膏組，差異有統計學意義（P<0.05），提示紫草油能通過下調Smad3因子的表達，進而有效促進創面的愈合。

綜上所述，TGF-β1/Smad3信號通路可多方面調節細胞增殖、分化及纖維化等過程[20]。本實驗研究提示紫草油能促進肛瘺術后創面的愈合及縮短愈合時間，可能通過調節TGF-β1/Smad3信號轉導通路中TGF-β1及Smad3 因子表達水平。因此如何根據 TGF-β1/Smad3通路的變化規律，有針對性地進行科學地調控，也是我們進一步研究的難點。

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（收稿日期：2018-07-02 本文編輯：許俊琴）