加強結核病病理學診斷的臨床應用與研究

陳文 李寧

結核病是全球死亡例數最多的傳染性疾病，WHO公布的數據顯示，2016年全球約有1040萬例新發結核病患者，130萬例HIV檢測陰性的結核病患者死亡。近幾年，結核病的發病率和死亡率均呈下降趨勢，然而耐藥結核病發病率卻顯著增加，2016年全球耐利福平結核病患者新發60萬例，其中49萬例為耐多藥結核病[1]。隨著分子生物學技術的快速發展，結核病病理學診斷可以為臨床提供更為精準、明確的診斷，特別是結核病與非結核分枝桿菌病的鑒別診斷，耐藥結核病的突變位點檢測等。

國家衛生和計劃生育委員會于2017年11月9日發布了《WS 196—2017結核病分類》與《WS 288—2017肺結核診斷》兩項強制性衛生行業標準，并且于2018年5月1日起施行；同時廢止《WS 196—2001結核病分類》和《WS 288—2008肺結核診斷》。在《WS 288—2017肺結核診斷》標準(簡稱“新標準”)中，顯著提高了病理學診斷在肺結核診斷和精準治療中的地位，筆者就此結合參考文獻進行解讀，以利于新標準的正確實施，使大家進一步明確和了解病理學診斷對于結核病的早期診斷和精準治療所具有的重要意義。

結核病的分類及病理改變

結核病是由結核分枝桿菌復合群引起的傳染性疾病，按照發病部位可分為肺結核與肺外結核。新標準將氣管、支氣管和胸膜結核均歸類于肺結核。肺外結核多發生于淋巴結、骨與關節、皮膚和腸道等。

肺結核的病理改變主要包括滲出性病變、增生性病變和變質性病變。增生性病變是結核病病理形態學最有特征性的改變，顯微鏡下可見具有診斷價值的結核結節，由上皮樣細胞、郎罕多核巨細胞，以及外周聚集的淋巴細胞和少量增生的成纖維細胞構成。典型者結節中央有干酪樣壞死，多為灰黃色，質地細膩形似奶酪。典型結核(結核結節)的病理診斷較容易，而不具備典型結核病理變化的病例則常需要借助其他的檢測方法[2]。

肺結核的病理診斷方法

抗酸染色及結核分枝桿菌基因檢測是查找結核病病原學證據的主要手段[3]。新標準顯著提高了病理學檢測在肺結核診斷和精準治療中的地位，結核病理學診斷陽性的患者即可確診為肺結核;影像學 檢查結果支持肺結核的診斷,同時分子生物學檢查 陽性的患者也可以確診為肺結核?

一、常規病理學診斷

常規病理標本的診斷主要包括大體檢查和顯微鏡下檢查兩部分。典型患者大體檢查可以看到有灰黃色，質地細膩形似奶酪的壞死組織(干酪樣壞死)，這對于結核病的診斷具有一定的提示作用；然而目前藥物化療仍然是結核病的主要治療手段，手術治療只有在很少的情況下進行，因此一般情況下很難獲得完整的結核病灶組織。顯微鏡下檢查主要是觀察到典型的肉芽腫伴干酪樣壞死病變[4]；應該注意的是，肉芽腫病變并非結核病所特有，亦可出現在霉菌病、結節病等其他病變中，因此常規的病理學診斷并非結核病診斷的金標準，在病理學診斷中應該結合其他檢測手段。

二、特殊染色

診斷結核病變，需要在病變區找到結核病原菌，抗酸染色是最常用的特殊染色方法。切片染色后顯微鏡下常常可以在壞死區中心或者壞死區與上皮樣肉芽腫交界處查見紅染的兩端呈鈍圓并稍彎曲的短棒狀桿菌。在抗酸染色檢測中應該注意除了結核分枝桿菌，麻風分枝桿菌和非結核分枝桿菌也是抗酸染色陽性桿菌，肉眼很難分辨，需要進一步鑒別；抗酸染色陽性率一般較低，抗酸染色陰性不應輕易否定結核分枝桿菌的存在。金胺O熒光染色與抗酸染色的原理類似，均是利用抗酸桿菌的嗜石炭酸性，在熒光顯微鏡下可以查見亮綠色熒光的桿菌，且在暗視野下較抗酸染色更醒目。陳順平等[5]采用金胺O熒光染色檢測了175例臨床確診為結核病患者的組織，發現金胺O熒光染色陽性率高達68.6%，遠遠高于抗酸染色，但該方法需要紫外光源，且無法長期保存。此外，網狀纖維染色、六胺銀和過碘酸鹽希夫染色均對結核病的診斷和鑒別診斷具有一定的價值[6]。網狀纖維染色能夠輔助判斷結核病的干酪樣壞死，六胺銀和過碘酸鹽希夫染色對于結核病的直接診斷沒有太大的價值，但可以有效地對真菌進行鑒別診斷。

三、分子生物學檢查

近幾年，基于基因檢測的分子病理新技術飛速發展，在有效提高組織標本中結核分枝桿菌檢出率的同時，還能鑒別結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌，分析結核分枝桿菌對抗結核藥物的耐藥性和敏感性，為結核病早期診斷和精準治療提供了更多的依據。實時熒光定量多聚酶鏈反應(RT-PCR)是目前臨床應用最為廣泛的分子病理學檢測技術，具有操作簡便、成本低廉和快速靈敏等優點[7]。對于一些陳舊性結核病變，僅有凝固性壞死和纖維化病變，在抗酸染色未找到結核分枝桿菌的情況下，應用PCR對結核分枝桿菌DNA進行檢測，敏感度和特異度高，對于結核病的確診具有很好的幫助。插入序列6110(IS6110)是結核分枝桿菌基因組中的一個保守片段，其由于拷貝數較多，在同一結核分枝桿菌基因組中十分穩定，因此成為了分子生物學檢測結核病的首選和最常用的片段[8]。然而并非所有的結核分枝桿菌均表達IS6110；Rv0577是PCR檢測結核感染的另外一種常用片段[9]，IS6110和Rv0577基因雙重PCR可以顯著地提高結核感染檢測的特異度和敏感度。應該特別注意的是，基于PCR的分子病理檢測方法敏感度很高，外源性DNA的污染很容易引起假陽性的出現，因此分子病理檢測需在符合國家標準的臨床基因擴增實驗室中，由受過專門培訓的專業人員按照規范化操作規程進行，以保證檢測結果的準確性。

利福平和異煙肼是目前的一線抗結核化療藥物，近年來耐藥結核病患者的發生率越來越高，分析結核分枝桿菌的耐藥性對于結核病的精準治療具有重要的意義。核酸雜交技術在分枝桿菌菌種鑒定，以及耐藥結核病的診斷中具有很強的優勢。此外，該技術還可以實現一次實驗中檢測結核分枝桿菌對多種抗結核藥物耐藥的相關基因突變。結核分枝桿菌rpoB基因突變是導致耐利福平的主要機制之一，katG、inhA基因突變則在結核分枝桿菌對異煙肼耐藥中發揮著重要作用，利用PCR和核酸雜交技術可以快速檢測這些基因的突變位點，判斷結核分枝桿菌的耐受種類和數量，為下一步的精準治療提供指導[10-12]。

四、免疫組織化學染色

免疫組織化學具有操作簡便、敏感性高、可長期保存等優勢，在疾病的診斷，特別是腫瘤的確診和分型中被廣泛應用。然而，目前尚無可應用于臨床診斷的針對結核分枝桿菌特異抗原的抗體，因此新標準中也沒有涉及免疫組織化學在結核病診斷中應用的內容。結核病免疫組織化學染色主要使用兩種類型的抗體。第一種類型是針對不同細胞類型的抗體。如抗CD68抗體可以幫助區分類上皮細胞與上皮來源細胞，有助于確認肉芽腫結構，但對于結核病的診斷沒有很大幫助。第二種類型是針對結核分枝桿菌特異抗原的抗體。這類抗體可以在組織切片中顯示結核分枝桿菌蛋白的表達，對協助結核病診斷很有幫助。目前，報道的抗體主要識別BCG成分、MPT64、PstS1、Ag85B等抗原[13-14]。Ag85B抗原是結核分枝桿菌最主要的分泌蛋白，在結核病的發生和發展中發揮著重要作用。有研究報道，Ag85B免疫組織化學檢測結核感染的敏感度為53.8%，遠遠高于抗酸染色(34.4%)。Che等[15]報道了一種新的抗酸染色-免疫組織化學(Z-C)染色法，通過同時進行抗酸染色和檢測Ag85B抗原，其敏感度達到了65.6%，優于單獨的抗酸染色和免疫組織化學檢測結果。適配體是一種能夠特異性結合蛋白、細胞和細菌的核酸序列，Thakur等[16]基于MPT64抗原，設計了一段核酸適配體，能夠有效地檢測結核分枝桿菌感染，特異度和敏感度均很高。結核分枝桿菌特異性抗體的研發和臨床轉化可能是未來結核病診斷和治療的一個熱點。

肺結核的鑒別診斷

非結核分枝桿菌是分枝桿菌屬中除結核分枝桿菌復合群和麻風分枝桿菌以外其他分枝桿菌的統稱[17]。非結核分枝桿菌肺病臨床表現酷似肺結核，多繼發于慢性肺病或者免疫缺陷疾病。其組織病理學基本改變類似于結核病，抗酸染色均為陽性，形態也非常相似。但非結核分枝桿菌肺病的組織學改變以類上皮細胞肉芽腫改變多見，無明顯干酪樣壞死。膠原纖維增生且多呈玻璃樣變，這是與結核病組織學改變區別的主要特點。如要明確分枝桿菌的類型，需要進行分子病理學檢測或新鮮組織培養。

真菌病是除了分枝桿菌病以外最為常見的感染性肉芽腫疾病，HE常規切片結合特殊染色可以進行很好的鑒別。寄生蟲感染也可引起肉芽腫病變，但是病原蟲體積大，不需要特殊染色，在HE常規切片中就可以清楚識別。麻風分枝桿菌可形成肉芽腫，亦可形成結核樣結節，結節中心可見壞死。抗酸染色可在瘤型和界線型麻風病變中查見大量麻風分枝桿菌；但在結核型和未定型麻風病變中麻風分枝桿菌非常少，明確診斷需通過基因檢測進行菌種鑒定。其他一些非感染性肉芽腫疾病，如結節病、肉芽腫性血管炎和嗜酸性肉芽腫血管炎等，均可通過抗酸染色及結核分枝桿菌DNA檢測加以鑒別[18-20]。應該引起注意的是，肺結核常常并發肺部腫瘤，在肺結核發病的基礎上，肺癌的診治平均延誤時間為3～18個月，此時應該綜合影像學和病理學方法進行甄別，以免延誤腫瘤的治療[21]。

展 望

近年來，結核病的發病特點和流行趨勢均發生了很大的變化，耐多藥和廣泛耐藥結核分枝桿菌的出現使全球抗結核的防治形勢日益嚴峻。結核病的早期診斷和精準治療至關重要，病理學診斷在這個過程中發揮著越來越重要的作用。肺結核診斷新標準中顯著提高了病理學檢測在肺結核診斷和治療中的地位，采用分子病理學技術可以快速診斷結核分枝桿菌感染和檢測其耐藥性。然而目前仍存在許多問題，比如臨床上仍沒有敏感度與特異度十分滿意的可用于結核感染檢測的特異性抗體。相信隨著分子生物學的進一步發展，將會給結核病病理學診斷帶來新的契機。

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