兒童結核病的診斷新進展

夏露　張峣　盧水華

結核病是當前導致發展中國家兒童死亡的主要疾病之一，2016年世界衛生組織(WHO)報道全球新發兒童結核病患者100萬例，死亡14萬例[1]。英國謝菲爾德大學研究組在《柳葉刀·全球衛生》上的研究表明，利用新的計算模型來估算2015年全球兒童因結核病死亡的人數，5歲以下的兒童死于結核病的例數大約為20萬例[2]，這個數據說明WHO關于兒童結核病的數據有可能被低估。

中國的兒童結核病疫情同樣不容樂觀，2016年WHO報道中國兒童結核病患者發病例數為7.5萬例(其中女3.7萬例，男3.8萬例)[1]。全國第四次結核病流行病學抽樣調查結果顯示，0～14歲兒童結核病感染率為9%，活動性肺結核患病率為91.8/10萬，估算約有2608萬例兒童感染結核分枝桿菌，活動性肺結核患兒約26.6萬例。其中，兒童菌陽肺結核的患病率為12.3/10萬，兒童涂陽肺結核的患病率為6.7/10萬[3]。

龐大的患病率必然使兒童結核病成為WHO關注的焦點，2014年WHO出版了《國家結核病規劃關于兒童結核病處理指南》[4]，并從戰略上提出了《全球兒童結核病零死亡率藍圖》[5]，可以展望兒童結核病的防控未來將獲得長足進步。但是由于兒童具有咳嗽反射較弱、細菌載量較低、痰標本獲取較為困難、痰涂片陽性率較低，以及肺外結核所占比例較高等特點，兒童結核病的診斷目前仍面臨著巨大的挑戰，零死亡率短期內尚不可能實現。降低死亡率的重點是要提高兒童結核病的早期診斷率，實驗室檢查是結核病診斷、治療及預防控制的重要依據。近年來出現了一些新的診斷方法用于診斷兒童結核病，譬如γ干擾素釋放試驗(IGRA)、分子診斷技術、早期分泌靶抗原-6(ESAT-6)和培養濾液蛋白-10(CFP-10)融合蛋白皮膚試驗等，大大提高了兒童結核病的確診率，筆者對以上診斷方法在兒童結核病中的最新進展進行綜述。

一、IGRA

目前，結核分枝桿菌特異性的IGRA已被WHO列入結核病的診斷指南, 并且已推薦用于幫助診斷兒童的潛伏結核感染和結核病[6]。它主要是用兩種結核特異性蛋白——ESAT-6及CFP-10，來刺激外周血中結核特異性T淋巴細胞釋放γ干擾素(IFN-γ)，從而進行檢測。根據檢測方法的不同，IGRA主要有兩種技術：一種是酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，另外一種是結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)。研究顯示，這兩種方法對結核感染的診斷價值相當[7]。Shimizu等[8]入組了52例15歲以下的潛伏結核感染或活動性結核病患者，所有患者均行T-SPOT.TB與結核菌素皮膚試驗(TST)，結果發現T-SPOT.TB檢測為陽性的患者有9例(17.3%)，TST試驗結果為陽性的患者有12例(23.1%)，有7例患者出現T-SPOT.TB與TST試驗結果不一致的情況，這7例患者結合影像學檢查資料及與結核病患者接觸史，均提示有潛伏結核感染或活動性結核病；可見，單用T-SPOT.TB或TST可能會誤診，建議聯合應用T-SPOT.TB與TST檢查提高診斷率。孫琳等[9]關于T-SPOT.TB在不同年齡活動性結核病患兒診斷中的應用價值的一項研究發現，在1072例研究對象中，T-SPOT.TB的敏感度與TST試驗相近，特異度高于TST試驗，該研究證明了T-SPOT.TB在各年齡階段的兒童均具有較好的敏感度和特異度，在活動性結核病患兒的輔助診斷中具有一定的應用價值。

Bielecka等[10]的研究分析了ELISA檢測中IFN-γ在不同年齡兒童中、不同采血管中釋放水平的差別。該研究共入組153例疑似結核病患兒，其中，45例兒童年齡≤5歲，108例兒童年齡>5歲；在陽性對照管中，IFN-γ水平與年齡呈正相關，在結核抗原管中呈負相關，也就是說患者年齡越小，IFN-γ水平越高。該研究顯示ELISA在≤5歲的活動性結核病及潛伏結核感染的患兒中有良好的應用價值，并且其與TST的一致性達到82.52%。Lombardi等[11]的研究進一步驗證了年齡越小，ELISA檢測出來的IFN-γ水平越高；此外，該研究還進一步說明，IFN-γ在活動性結核病患者中的水平高于潛伏結核感染患者。Sollai等[12]對IGRA在兒童中的應用價值進行了Meta分析，該文章一共包括31項ELISA研究(6183例兒童)，14項T-SPOT.TB研究(2518例兒童)，34項TST研究(6439例兒童)。結果發現，在高收入國家，IGRA檢測的敏感度和特異度均高于TST試驗；而在低收入國家，IGRA的優勢并不明顯。

總體來說，IGRA不受機體免疫力及卡介苗(BCG)接種的影響，對潛伏期、不典型結核、肺外結核，以及HIV并發結核感染具有較高的診斷價值，但是否為活動性結核病，IGRA需要結合臨床癥狀及其他檢測指標進行綜合判斷，以便準確區分活動性結核病和潛伏期結核感染。

二、GeneXpert MTB/RIF檢測

本系統是一種半定量巢式實時聚合酶鏈式反應(PCR)體外診斷試驗，實時PCR技術和反轉錄PCR技術相結合，可以同時檢測結核分枝桿菌和其對利福平的耐藥性，2 h可以獲得檢測結果[13]。WHO建議GeneXpert MTB/RIF(以下簡稱“Xpert”)可取代痰涂片和痰培養檢測，作為檢測疑似肺結核、疑似耐多藥肺結核或并發HIV感染的首選方法[4]。目前，各國關于Xpert在兒童結核病不同診斷金標準、不同樣本種類、數量及保存條件、不同并發癥患兒中的應用都有大量報道。

當選取不同金標準時，Xpert敏感度、特異度不同。以結核分枝桿菌培養為金標準時，美國Detjen等[14]對Xpert檢測在兒童肺結核的應用進行了Meta分析，總共納入15項研究，包括3640例兒童肺結核患者，4768個呼吸樣本；研究結果發現，痰液Xpert檢測的敏感度和特異度分別為62%和98%，胃液Xpert檢測的敏感度和特異度分別為66%和98%。以綜合臨床參考標準(composite clinical reference standard，CCRS)為金標準時，Nhu等[15]的研究發現，Xpert檢測在肺結核患兒中的敏感度可達50.0%，明顯高于痰培養及痰涂片；Xpert檢測的陽性率較結核分枝桿菌培養高33.9%，較抗酸染色鏡檢高48.7%以上。中國的一項研究發現，支氣管肺泡灌洗液的結核分枝桿菌涂片、培養和Xpert檢測的敏感度分別為8.4%、28.9%和53%，3種檢測方法的特異度均為100.0%[16]，該研究證明Xpert檢測的診斷敏感度遠遠高于培養。南非的一項研究納入了102例疑似骨關節結核患者，其以病理結果為金標準，發現Xpert檢測的敏感度和特異度分別為73.9%、100.0%[17]。

不同樣本種類、數量及儲存方法對Xpert的檢測結果影響較大。南非Bunyasi等[18]發現，采集患者 1 份胃液進行Xpert檢測的敏感度、特異度分別為9.4%、99.9%，2份胃液進行檢測的敏感度、特異度分別為22.6%、99.4%；采集患者1份誘導痰進行檢測的敏感度、特異度分別為22.6%、100%，2份誘導痰進行檢測的敏感度、特異度分別為26.7%、100%。印度Singh等[19]的研究納入130例肺結核患兒，每例患者均連續2 d 收集誘導痰及胃液行檢查，也發現連續 2 d 收集樣本可明顯增加培養及Xpert檢測的陽性率。此外，該研究將所有標本儲存于-80 ℃環境中，發現在保存650～849 d的涂片陽性標本中，誘導痰和胃液進行Xpert檢測的敏感度分別為85.7%和77.1%；如果保存超過1050 d，敏感度則分別下降到33.3%和50.0%。Banada等[20]進行了糞便Xpert檢測診斷肺結核的研究，該研究入組了痰液或胃液Xpert檢測陽性的20例確診肺結核的兒童及20例非結核病兒童，分別取患兒0.2 g、0.6 g和1.2 g糞便進行Xpert檢測，發現用0.6 g糞便進行Xpert檢測時，敏感度、特異度最高，分別為85%、100%。

患者的并發癥、營養狀況也可能影響Xpert檢測的結果。Chisti等[21]報道了在嚴重營養不良和重癥肺部感染兒童中，采用誘導痰和胃液進行Xpert檢測的診斷率均較培養高。

以上關于Xpert檢測的報道中，多數報道Xpert檢測的敏感度低于痰培養檢查[14,18-20]，少量研究提示Xpert檢測的敏感度高于結核分枝桿菌培養，考慮可能與Xpert檢測陰性的患者隨訪缺失，造成敏感度假性升高有關。總體來說，Xpert檢測在兒童肺結核及耐藥結核病的診斷效能較高，聯合培養可提高兒童結核病的確診率，且操作簡便，檢出時間快，是目前較為理想的兒童結核病診斷方法。

目前，最新一代Xpert MTB/RIF Ultra檢測(簡稱Xpert Ultra)已問世，傳統Xpert檢測的最小檢出菌量為131 CFU/ml，BACTEC MGIT培養的最小檢出菌量為10～100 CFU/ml[14]，而Xpert Ultra檢測最小檢出菌量僅為10 CFU/ml。一項大型前瞻性多中心研究顯示，Xpert Ultra的敏感度高于Xpert，但兩者在檢測是否對利福平耐藥時差異無統計學意義[22]。Xpert Ultra用于兒童結核病的檢測效能目前尚未見文章報道，相信未來2年應該有兒童結核病應用Xpert Ultra檢測的研究出現。

其他的分子生物學技術還包括環介導等溫擴增技術(LAMP)、RNA恒溫擴增實時熒光檢測技術(SAT)、線性探針技術(LPA)等，但其應用于兒童的數據極少，暫且不進行詳細闡述。

三、重組ESAT-6和CFP-10融合蛋白皮試試驗

TST是診斷結核病的一種傳統方法，其操作簡便易行，成本低廉。但TST缺少預期的特異度及敏感度，由于BCG接種較為普及，非結核分枝桿菌感染率也較高，使TST出現了較高的假陽性率，診斷特異度較低。CFP-10與ESAT-6僅存在于結核分枝桿菌復合群和少數致病性結核分枝桿菌基因組中，所有BCG菌株及絕大部分環境分枝桿菌(海分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶發分枝桿菌、微黃分枝桿菌除外)基因組均無該區基因。因此，目前由重組ESAT-6和CFP-10融合蛋白制成的結核診斷試劑已成為熱點，如丹麥國立血清研究所的C-Tb皮試試驗、俄羅斯的“diaskintest (DST)”皮膚試驗、中國的ESAT6-CFP10(EC)皮試試驗，均是研究較系統、規模較大的團隊。2017年丹麥Morten Ruhwald 研究團隊[23]關于C-Tb皮試的研究發表在《柳葉刀-呼吸醫學雜志》上，該試驗在2012—2014年期間共入組了979例受試者(其中5歲以下受試者共35例，5～17歲受試者共86例)，所有受試者均行TST、ELISA、C-Tb檢測。結果發現，隨著結核感染風險增加，C-Tb的陽性率也逐步增高，在活動性結核患者里面，C-Tb陽性率稍低于ELISA，C-Tb與TST檢測安全性相當。Slogotskaya等[24]的研究共納入2609例成年及未成年的肺結核、肺外結核、潛伏結核感染、非結核病、接種BCG的受試者，所有受試者均行DST試驗及TST試驗。該研究結論說明DST試驗在所有類型兒童及青少年受試者中，都具有很高的敏感度和特異度。在中國開展的重組結核分枝桿菌EC變態反應原人體臨床試驗Ⅰ、Ⅱa期已完成，EC皮試后24～72 h診斷的敏感度為85.88%，特異度為92.86%，與皮試前T-SPOT.TB檢查的診斷一致率達90.07%。同時證實，重組蛋白EC在健康人群和肺結核患者中檢測的安全性良好，皮試后無潛在增敏風險，診斷敏感度和特異度與T-SPOT.TB相當，而明顯優于TST[25-26]。目前，中國EC Ⅲ期在兒童結核病中的臨床試驗目前已完成，相關數據暫未公布。

總之，ESAT-6和CFP-10融合蛋白皮試試劑無BCG的交叉反應，價格便宜，容易操作，以后在兒童結核病診斷中的應用前景較樂觀。

四、臨床癥狀診斷

WHO推薦基于癥狀的篩查方法可以提高兒童結核病的診斷率[27]。Mulenga等[28]的研究一共入組了1017例疑似肺結核的患兒，持續咳嗽在臨床診斷肺結核的患兒中陽性率為16.9%(172/1017)，結核分枝桿菌培養及Xpert檢測的總陽性率為3.7%(38/1017)，X線胸部攝影檢查的陽性率為12.9%(131/1017)，咳嗽的OR值是培養及Xpert檢測陽性率的3倍，并且持續咳嗽是唯一在重癥肺結核及非重癥肺結核中有差別的癥狀。Triasih等[29]的研究顯示，在98例有體質量減輕和咳嗽、發熱等癥狀的兒童里面，有21%的兒童患者最后被診斷為肺結核；171例無結核感染相關癥狀的患者，最終0例確診為活動性結核病。該研究表明，基于癥狀診斷結核病是一種簡單而安全的篩查方法，可以在初級保健水平上實施。總體來說，有以下3條癥狀的兒童應高度懷疑活動性結核病[30]：(1)持續咳嗽2周以上；(2)近3個月內發育遲緩；(3)乏力。

此外，相應器官的影像學檢查、血紅細胞沉降率、結核抗體、組織活檢等均有利于兒童結核病的診斷，因以上檢查特異度不高，需結合病原學、分子生物學檢查聯合判斷，且近幾年在兒童結核病的診斷方面無較多進展，在此不一一詳述。

綜上所述，我國目前兒童結核病流行的趨勢還相當嚴峻。在診斷兒童結核病時，由于取得細菌學診斷依據較難，現有實驗室或影像學檢查都不能達到令人滿意的診斷敏感度，故我們應采取多樣本、多個診斷測試的組合以獲得更好的診斷收益。隨著新技術的不斷涌現，多種有潛力的新診斷方法被開發并逐步在臨床應用，例如現代分子生物學方法是目前較好的診斷技術，可快速地為病原學診斷提供重要的線索。但無論哪種方法均各有優劣，對兒童結核病還需結合臨床表現及多種聯合診斷方法的檢測結果加以綜合診斷。

[1] World Health Organization. Global tuberculosis report 2016. Geneva:World Health Organization,2016.

[2] Dodd PJ, Yuen CM, Sismanidis C, et al. The global burden of tuberculosis mortality in children: a mathematical modelling study. Lancet Glob Health,2017,5(9):e898-906.

[3] 全國結核病流行病學抽樣調查技術指導組，全國流行病學抽樣調查辦公室.第四次全國結核病流行病學抽樣調查報告.中華結核和呼吸雜志, 2002, 25(1):3-7.

[4] WHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee.Guidance for National Tuberculosis Programmes on the Management of Tuberculosis in Children. 2nd ed.Geneva: World Health Organization,2014.

[5] World Health Organization.Childhood TB training toolkit. Geneva:World Health Organization, 2014.

[6] World Health Organization. Use of Tuberculosis Interferon-Gamma Release Assays (IGRAs) in Low- and Middle- Income Countries: Policy Statement. Geneva： World Health Organization, 2011.

[7] 李鋒, 盧水華. γ干擾素釋放試驗在兒童結核病和潛伏結核感染中的診斷價值. 中國防癆雜志, 2015, 37(7):732-735.

[8] Shimizu H, Mori M.Usefulness of the Combination of Tuberculin Skin Test and Interferon-Gamma Release Assay in Diagnosing Children with Tuberculosis.Tohoku J Exp Med，2017，243(3):205-210.

[9] 孫琳, 田建嶺, 尹青琴,等. γ干擾素釋放試驗在不同年齡活動性結核病患兒診斷中的應用價值. 中國防癆雜志, 2015, 37(7):757-763.

[10] Bielecka T, Komorowska-Piotrowska A, Krenke K, et al. Is secretion of IFN-gamma in response toMycobacteriumtuberculosisantigens in youngest children sufficient to play a role in TB diagnostics. Pediatr Pulmonol, 2018, 53(2)：181-188.

[11] Lombardi G, Petrucci R, Corsini I, et al. Quantitative analysis of interferon-γ release assay response in children with latent and active tuberculosis.J Clin Microbiol, 2018，56(2)：e01360.

[12] Sollai S, Galli L, de Martino M, et al. Systematic review and meta-analysis on the utility of Interferon-gamma release assays for the diagnosis ofMycobacteriumtuberculosisinfection in children: a 2013 update.BMC Infect Dis, 2014, 14:S6.

[13] Boehme CC, Nabeta P, Hillemann D, et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N Engl J Med,2010,363(11):1005-1015.

[14] Detjen AK,DiNardo AR,Leyden J，et al. Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of pulmonary tuberculosis in children: a systematic review and meta-analysis. Lancet Respir Med, 2015，3(6): 451-461.

[15] Nhu NT,Ha DT,Anh ND，et al. Evaluation of Xpert MTB/RIF and MODS assay for the diagnosis of pediatric tuberculosis. BMC Infect Dis, 2013, 13:31.

[16] Yin QQ, Jiao WW, Han R，et al. Rapid diagnosis of childhood pulmonary tuberculosis by Xpert MTB/RIF assay using bronchoalveolar lavage fluid. Biomed Res Int, 2014，2014:310194.

[17] Held M, Laubscher M, Mears S，et al. Diagnostic Accuracy of the Xpert MTB/RIF Assay for Extrapulmonary Tuberculosis in Children With Musculoskeletal Infections. Pediatr Infect Dis J, 2016，35(11): 1165-1168.

[18] Bunyasi EW, Tameris M, Geldenhuys H, et al. Evaluation of Xpert?MTB/RIF Assay in Induced Sputum and Gastric Lavage Samples from Young Children with Suspected Tuberculosis from the MVA85A TB Vaccine Trial. PLoS One, 2015, 10(11):e0141623.

[19] Singh S, Singh A, Prajapati S, et al. Xpert MTB/RIF assay can be used on archived gastric aspirate and induced sputum samples for sensitive diagnosis of paediatric tuberculosis. BMC Microbiol, 2015, 15:191.

[20] Banada PP,Naidoo U,Deshpande S， et al. A Novel Sample Processing Method for Rapid Detection of Tuberculosis in the Stool of Pediatric Patients using the Xpert MTB/RIF assay. PLoS One, 2016, 11(3):e0151980.

[21] Chisti MJ, Graham SM, Duke T，et al.A prospective study of the prevalence of tuberculosis and bacteraemia in Bangladeshi children with severe malnutrition and pneumonia including an evaluation of Xpert MTB/RIF assay. PLoS One, 2014,9(4):e93776.

[22] Dorman SE, Schumacher SG, Alland D, et al. Xpert MTB/RIF Ultra for detection ofMycobacteriumtuberculosisand rifampicin resistance: a prospective multicentre diagnostic accuracy study.Lancet Infect Dis, 2018,18(1):76-84.

[23] Ruhwald M,Aggerbeck H,Gallardo RV, et al. Safety and efficacy of the C-Tb skin test to diagnoseMycobacteriumtuberculosisinfection, compared with an interferon γ release assay and the tuberculin skin test: a phase 3, double-blind, randomised, controlled trial. Lancet Respir Med,2017,5(4):259-268.

[24] Slogotskaya L, Litvinov V, Kochetkov Y, et al. New skin test with recombinant protein CFP10-ESAT6 in patients (children and adults) with tuberculosis, non-tuberculosis disease and latent TB infection. European Respiratory Journal, 2012.

[25] Li F, Xu M, Qin C, et al. Recombinant fusion ESAT6-CFP10 immunogen as a skin test reagent for tuberculosis diagnosis: an open-label, randomized, two-centre phase 2a clinical trial. Clin Microbiol Infect, 2016, 22(10):889.

[26] Li F, Xu M, Zhou L, et al. Safety of recombinant fusion protein ESAT6-CFP10 as a skin test reagent for tuberculosis diagnosis: an open-label, randomized, single-center phase I clinical trial. Clin Vaccine Immunol, 2016,23(9):767-773.

[27] World Health Organization. Guidance for national tuberculosis programmes on the management of tuberculosis in children. Geneva: World Health Organization, 2006.

[28] Mulenga H,Tameris MD,Luabeya KK,et al.The Role of Clinical Symptoms in the Diagnosis of Intrathoracic tuberculosis in Young Children. Pediatr Infect Dis J, 2015,34(11): 1157-1162.

[29] Triasih R, Robertson CF, Duke T, et al. A prospective evaluation of the symptom-based screening approach to the management of children that are contacts of tuberculosis cases.Clin Infect Dis, 2015, 60(1):12-18.

[30] Kumar MK, Kumar P, Singh A. Recent advances in the diagnosis and treatment of childhood tuberculosis. J Nat Sci Biol Med, 2015,6(2):314-320.