重視新型實驗室技術　助力菌陰肺結核診斷

安軍　逄宇

結核病仍然是危害人類身體健康的重大公共衛生問題，全球每年新發結核病患者超過1000萬例，同時有近170萬例患者死于結核病[1]。結核病的早期診斷不僅可以提高患者預后，同時對于有效控制結核病在人際之間的傳播具有重要意義[2]。菌陰肺結核是指診斷缺乏痰涂片和培養依據的活動性肺結核。據估算，我國菌陰肺結核患者約占所有肺結核患者的70%[3]。由于菌陰肺結核患者缺乏特異性臨床表現，僅依靠醫生的臨床經驗進行診斷易造成誤診、過診和漏診[3]，因此，迫切需要快速、準確、價廉的診斷技術為其診斷提供實驗室證據。此外，中華人民共和國國務院辦公廳頒布的《“十三五”全國結核病防治規劃》中明確指出，到2020年，我國肺結核患者病原學陽性率達到50%以上[4]。因此，菌陰肺結核的診斷值得我們進一步關注。

一、努力提升現有結核病實驗室診斷的質量

痰涂片和培養仍然是我國現階段結核病患者發現最主要的實驗室檢查手段，然而，兩種細菌學檢查方法受到諸多因素的影響[5]。研究表明，細菌學檢查的影響因素之一就是痰標本質量，唾液痰中結核分枝桿菌陽性檢出率明顯低于其他類型的痰標本[6]；同樣，實驗室質量控制存在問題將在細菌學檢查中容易造成假陰性的發生，其影響因素有試劑質量、操作規范程度等[7]。因此，需要首先甄別菌陰肺結核患者中部分由標本質量等因素造成的“假陰性”。應重點關注標本質量和操作規范，加強與臨床人員的溝通，強化標本質量在檢測效果中重要意義的認識；同時，努力提升結核病實驗室檢測質量，從而提高結核病患者病原學檢測的陽性率。

二、合理應用現有的菌陰肺結核診斷的適宜技術

當細菌學檢測方法對于痰標本“束手無策”時，分子生物學技術、免疫學技術和病理學技術可為結核病實驗室診斷提供重要補充。然而，如何理解并合理應用現有的菌陰肺結核診斷的適宜技術，并且服務于臨床一直存在爭議。

(一)綜合運用菌陰肺結核診斷的分子生物學技術

近年來，隨著分子生物學技術發展的突飛猛進，涌現出一批用于結核病早期診斷的快速診斷技術[5]。多中心大樣本臨床評估結果表明，多種分子生物學檢測技術不僅對菌陽肺結核患者具有很高的檢出率，而且對于菌陰肺結核患者也具有一定的陽性檢出率[8-10]。上述研究成果拓展了分子生物學檢測技術用于菌陰肺結核診斷的應用前景，特別是2013年世界衛生組織修訂了結核病的診斷標準，將世界衛生組織推薦的分子生物學檢測技術陽性檢出結果視同于細菌學檢測陽性，作為病原學陽性結核病的診斷依據[11]。我國也于2017年修訂了肺結核診斷標準，將分子生物學技術檢測陽性結果作為病原學陽性結核病的診斷標準[12]，從而極大地補充了傳統細菌學檢測方法，積極發揮分子生物學檢測技術對于涂陰肺結核患者的診斷優勢，從而使其更好地服務于臨床。

(二)正視免疫學技術在菌陰肺結核診斷中的作用

結核病免疫學診斷技術主要包括血清結核抗體檢測、結核變態反應原皮膚試驗和結核特異性抗原γ干擾素體外檢測，三者均可輔助診斷結核病，特別是對于菌陰肺結核的診斷，上述3種免疫學方法均表現出了特有的優勢[13]。其中，血清學抗體檢測技術近年來由于其高度可變的敏感度和特異度，一直飽受詬病[14]。近期撰寫的關于結核抗體檢測的專家共識中系統分析了導致上述問題的原因，提出在提高產品自身質量的同時，優化檢測平臺，篩選能夠反映不同患者感染發病狀態的抗原組合，將是未來發展的方向[13]。第二，結核變態反應原皮膚試驗，即結核菌素試驗。一個世紀以來，結核菌素試驗一直廣泛用于結核病流行病學調查和監測，評價卡介苗接種質量及輔助結核病的診斷和鑒別診斷。但是由于其不能區分卡介苗接種與結核感染，因此，其檢測特異度受到很大影響。近期出現的人型結核菌素試驗，能夠排除上述混雜，尤其在菌陰肺結核患者的輔助診斷中可以提高檢測特異度，未來具有一定的應用前景[15]。第三，結核特異性抗原γ干擾素體外檢測試驗是目前國內外最主流的用于結核感染檢測的方法，特別是對于特殊人群，其可表現出很高的陽性率。因此，可以為菌陰肺結核的輔助診斷提供重要依據。兩項在人群中開展的研究表明，γ干擾素體外檢測結果受結核病診斷依據、痰菌量、既往結核病史或肺部陳舊性結核病灶、非結核分枝桿菌(NTM)感染、結核病灶部位等多種因素的影響[16-17]，因此，在將其用于輔助診斷菌陰肺結核時，需綜合考慮上述各項因素后做出判斷。值得注意的是，在實際工作中，不可忽視免疫學檢測方法的作用，更不能夸大其在結核病診斷中的作用。

(三)拓展病理學在結核病診斷中的作用

病理學診斷是細菌學之外最重要的結核病確診途徑之一，在痰菌陰性的肺結核及肺外結核的診斷中發揮著非常重要的作用[18]。傳統的肺結核病理學診斷主要采用抗酸染色及蘇木素-伊紅染色等。抗酸染色是尋找病原學依據的重要途徑，但其敏感度較低，在臨床診斷中通常結合“肉芽腫性炎癥”這一重要組織病理學特征。但是由于其他感染亦可能出現上述特征，因此，聯合其他結核特異性的檢測方法，對于提高病理學診斷菌陰肺結核的特異度具有重要意義[18]。本期董宇杰等[19]評價免疫組織化學及熒光定量PCR對結核病的診斷價值，與傳統抗酸染色法相比，其敏感度從27.1%分別提高到52.1%和60.4%，提示免疫學及分子生物學檢測方法可為結核病的診斷提供更加敏感和準確的依據。但是，病理學有創檢查的特點可能限制了其在菌陰肺結核診斷中的作用。

三、展望

盡管眾多新型診斷技術為臨床診斷菌陰肺結核提供了備選方案，但是菌陰肺結核實驗室診斷技術的效能仍然差強人意。并非是現有技術的敏感度不夠高，而是由于肺結核發病機制的復雜性所致。痰標本中含有的結核分枝桿菌菌量依賴于結核病灶進展，并與引流支氣管相通[20]，此時需要患者的病情進展到一定程度，而當患者在發病早期階段就診時，通常病灶中結核分枝桿菌并未進入氣管。因此，使用傳統的細菌學及分子生物學方法注定無法圓滿完成對這種早期菌陰肺結核患者的診斷。2009年，有研究報道采用檢測尿液中的脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)診斷結核病。LAM是一種結核分枝桿菌細胞壁成分，活躍代謝的結核分枝桿菌會合成大量的LAM并從細胞壁到血液，并部分進入尿液中。然而前期的評估結果表明，基于LAM的抗原檢測方法在HIV陽性的結核病患者中的敏感度達到67%，而在HIV陰性的結核病患者中的敏感度僅為14%。提示基于尿液的LAM檢測方法僅適于HIV感染的特殊人群[21]。2017年，美國科學家報道了一種基于對結核分枝桿菌分泌蛋白(培養濾液蛋白10和早期分泌靶抗原6)為標志物的抗原檢測方法，借助質譜技術可以從結核病患者血液中通過早期發現活躍代謝的結核分枝桿菌分泌的蛋白肽段，從而對菌陰肺結核患者進行診斷[22]。盡管上述新技術尚處于研發及上市審批階段，但是上述方法為結核病診斷提供了一種新思路，即開發基于結核分枝桿菌分泌抗原的新型診斷技術是未來診斷菌陰肺結核的重要方向之一。

此外，除了分泌抗原的檢測方法，尋找血液中新型診斷標志物也是結核病特別是菌陰肺結核診斷的新思路。近年來，基于外泌體發現的非編碼RNA被廣泛應用于腫瘤、精神類疾病的早期診斷[23]。外泌體中豐富的非編碼RNA使其檢測成為一種有巨大潛在價值的無創診斷方法。目前，對結核病外泌體的研究正處于早期階段，隨著對結核病患者血液轉錄組及代謝組學的不斷解析，未來將發現越來越多的適用于結核病早期診斷的標志物[24]。

加強菌陰肺結核的早期診斷，對于有效控制我國結核病疫情具有重要意義。努力提升現有實驗室診斷質量、綜合運用現有實驗室診斷技術將提高菌陰肺結核診斷的準確性。但是，鑒于結核病的發病機制，在血液中尋找適合結核病早期診斷的新型分子標志物及檢測平臺將從根本上彌補現有實驗室方法對于菌陰肺結核診斷的不足。

[1] World Health Organization. Global tuberculosis report 2017. Geneva: World Health Organization, 2017.

[2] van Cutsem G, Isaakidis P, Farley J, et al. Infection control for drug-resistant tuberculosis: early diagnosis and treatment is the key. Clin Infect Dis, 2016, 62 Suppl 3: S238-S243.

[3] 唐神結. 菌陰肺結核患者的臨床特征. 中華結核和呼吸雜志, 2005, 28(10): 674-676.

[4] 中華人民共和國國務院辦公廳.國務院辦公廳關于印發“十三五”全國結核病防治規劃的通知. 國辦發〔2017〕16號. 2017-02-01.

[5] Dorman S. Advances in the diagnosis of tuberculosis: current status and future prospects. Int J Tuberc Lung Dis, 2015, 19(5): 504-516.

[6] Cattamanchi A, Huang L, Worodria W, et al. Integrated strategies to optimize sputum smear microscopy: a prospective observational study. Am J Respir Crit Care Med, 2011, 183(4): 547-551.

[7] 楊新宇, 丁北川, 王甦民. 肺結核病人痰涂片鏡檢室間質量保證模式的評價研究. 中國防癆雜志, 2008, 30(1): 43-46.

[8] Lawn SD, Mwaba P, Bates M, et al. Advances in tuberculosis diagnostics: the Xpert MTB/RIF assay and future prospects for a point-of-care test. Lancet Infect Dis, 2013, 13(4): 349-361.

[9] Ou X, Li Q, Xia H, et al. Diagnostic accuracy of the PURE-LAMP test for pulmonary tuberculosis at the county-level laboratory in China. PLoS One, 2014, 9(5): e94544.

[10] Pang Y, Wang Y, Zhao S, et al. Evaluation of the Xpert MTB/RIF assay in gastric lavage aspirates for diagnosis of smear-negative childhood pulmonary tuberculosis. Pediatr Infec Dis J, 2014, 33(10): 1047-1051.

[11] World Health Organization. Definitions and reporting framework for tuberculosis-2013 revision. 2013. Geneva: World Health Organization, 2014.

[12] 中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會. WS 288—2017肺結核診斷. 2017-11-09.

[13] 《中國防癆雜志》編輯委員會, 中國醫療保健國際交流促進會結核病防治分會基礎學組和臨床學組. 現階段結核抗體檢測在我國臨床應用的專家共識. 中國防癆雜志, 2018, 40(1): 9-13.

[14] World Health Organization. Commercial serodiagnostic tests for diagnosis of tuberculosis: policy statement. Geneva: World Health Organization, 2011.

[15] 李衛彬, 侯琰, 程新征. 結核菌素試驗的臨床應用進展. 臨床肺科雜志, 2014, 19(4): 737-739.

[16] 尹洪云, WenLing Tan, 馬俊, 等. 結核感染T細胞斑點試驗在不同患者群中的檢測結果分析. 中國防癆雜志, 2018, 40(4): 358-364.

[17] 廉娟雯, 黨麗云, 許家玲, 等. 結核感染T細胞斑點試驗在惡性腫瘤并發結核病患者中的應用價值. 中國防癆雜志, 2018, 40(4): 353-357.

[18] 中華醫學會結核病學分會, 結核病病理學診斷專家共識編寫組. 中國結核病病理學診斷專家共識. 中華結核和呼吸雜志, 2017, 40(6): 419-425.

[19] 董宇杰, 張莉, 王宇軒, 等. 免疫組織化學及PCR技術在淋巴結結核病理診斷中的應用價值. 中國防癆雜志, 2018, 40(4): 348-352.

[20] 成詩明. 進一步提高我國涂陰肺結核的防治和管理水平. 中國防癆雜志, 2015, 37(5): 470-472.

[21] Lawn SD. Point-of-care detection of lipoarabinomannan (LAM) in urine for diagnosis of HIV-associated tuberculosis: a state of the art review. BMC Infect Dis, 2012, 12: 103.

[22] Liu C, Zhao Z, Fan J, et al. Quantification of circulatingMycobacteriumtuberculosisantigen peptides allows rapid diagnosis of active disease and treatment monitoring. Proc Natl Acad Sci U S A, 2017, 114(15): 3969-3974.

[23] 黃依瑤, 鄭磊. 重視外泌體的實驗診斷價值. 中華檢驗醫學雜志, 2015, 38(11): 724-726.

[24] Smith VL, Cheng Y, Bryant BR, et al. Exosomes function in antigen presentation during an in vivoMycobacteriumtuberculosisinfection. Sci Rep, 2017, 7: 43578.