耐亞胺培南的腸桿菌科細菌耐藥現狀及機制

俞丁寧 胡銘斐 王科枰 周芳美?

作者單位：310000 浙江中醫藥大學醫學技術學院

腸桿菌科細菌是寄居腸道的正常菌群，菌群失調時易造成尿路感染、血液感染等疾病，是醫院和社區獲得性感染的重要來源之一。亞胺培南為碳青霉烯類藥物，抗菌能力強，臨床上常把其作為多重耐藥菌感染患者治療的最后選擇［1］。隨著抗生素的廣泛使用，腸桿菌科細菌對亞胺培南出現耐藥現象，且耐藥率在世界范圍內呈上升趨勢，這限制了臨床用藥，威脅著人類的健康。近幾年“超級細菌”感染人數的增加，更是令人們對其擔憂。而研究腸桿菌科細菌對亞胺培南的耐藥機制，對控制感染性疾病的發生及臨床治療均有重要意義。

1 耐藥現狀

2017年耐碳青霉烯類抗生素的腸桿菌科細菌被世界衛生組織劃分為“1類重點病原體”，可見其對人類健康危害之大。北京協和醫院［2］與2016年全國細菌耐藥監測數據［3］均顯示耐亞胺培南的肺炎克雷伯菌近年來檢出率明顯上升，其中以ICU患者尤甚，可能是由于重癥患者的病情需要用更大劑量的抗生素來控制所造成的。衛計委全國細菌耐藥監測網（Mohnarin）2015-2016年革蘭陰性菌耐藥監測報告［4］中顯示，腸桿菌科細菌對亞胺培南普遍存在抗性，其中肺炎克雷伯菌和陰溝腸桿菌對亞胺培南的耐藥率在最近幾年內上升較快，需引起高度關注。

美國CDC在2011～2014年有關疾病控制的報告［5］中顯示腸桿菌科細菌對碳青霉烯類藥物耐藥率略有增加，以克雷伯菌屬和大腸埃希菌尤甚，如尿路感染分離的肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物耐藥率自2011年至2014年分別為10.7%、9.1%、10.9%、9.5%，均保持在10%的較高水平。EARS-Net 2016年報告［6］的歐洲耐碳青霉烯類大腸埃希菌檢出率＜1%，但耐藥肺炎克雷伯菌分離株檢出率較高。上述數據分析可見，耐亞胺培南等碳青霉烯類藥物的腸桿菌科細菌在不同地區都普遍存在，但耐藥菌的流行分布不同，其中耐藥肺炎克雷伯菌的檢出率在世界范圍內都較高，督促醫療機構需要采取更積極的措施以防止耐藥菌株的爆發。

2 耐藥機制

腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗生素亞胺培南耐藥的機制主要有四個方面，分別是產碳青霉烯酶、膜孔蛋白的丟失與改變、主動外排作用增強及青霉素結合蛋白的改變［7］。

2.1 產碳青霉烯酶 細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥，很重要的原因是產生了碳青霉烯酶使藥物滅活。碳青霉烯酶是指能夠明顯水解至少亞胺培南或者美羅培南的一類β-內酰胺酶。腸桿菌科細菌如大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產氣腸桿菌等菌株能夠產生許多滅活碳青霉烯酶類抗生素的酶，該酶按照Ambler分類分為四類，其中A、B、D三類被認為是碳青霉烯酶［8］。（1）A類碳青霉烯酶： A類碳青霉烯酶主要包括NmcA，KPC、SME，IMI-1/2、GES等，是一種絲氨酸碳青霉烯酶，能夠使碳青霉烯類、青霉素類、氨曲南類等多種抗生素水解滅活?？死S酸能夠抑制A類酶的活性，但其活性不被乙二胺四乙酸抑制［8］。1996年Yigit等［9］從一株耐藥的肺炎克雷伯菌中發現了KPC酶。之后，美國、以色列、法國、中國等國家相繼在多種腸桿菌科細菌中發現了這種酶。KPC酶有多種亞型，而在中國，耐亞胺培南的細菌主要產KPC-2型碳青霉烯酶［10］。產KPC酶是細菌獲得耐藥性的重要原因之一。Li等［11］發現大腸埃希菌獲得KPC-2基因后，對亞胺培南的耐藥性顯著增加。Su 等［10］通過基因測序粘質沙雷菌產生的KPC-2與大腸埃希菌的共培養物，再次證實了KPC-2對亞胺培南耐藥的作用。產KPC酶的菌株容易引起流行，這是因bla KPC基因位于可接合的質粒上，與轉座子Tn4401結合，兩側的插入序列可以跟隨轉座子實現在不同菌株間的轉移，其中ST -258序列有助于bla KPC基因的擴散［12］。這種傳播機制明顯加快細菌耐藥性的傳播。此外，在耐亞胺培南的腸桿菌科細菌中還發現較多其他A類酶，如NmcA、GES酶等，其中GES存在多種有水解活性的變異體，以GES-5對亞胺培南水解活性最強［13-14］。由此可見，酶發生變異，產生新的衍生物是近年來腸桿菌科細菌耐藥性不斷增強的重要原因之一。（2）B類碳青霉烯酶：B類碳青霉烯酶為金屬酶，主要包括VIM、IMP、NDM-1等，可以水解除氨曲南之外的所有β-內酰胺類抗生素，其活性能被乙二胺四乙酸抑制，但不受到克拉維酸的抑制［8］。從粘質沙雷菌中分離第一個IMP-1到現在，已知的IMP酶變異體有48種，我國較為常見的為IMP-4，其通過質粒在菌株間傳播，引起流行［15］。而目前產NDM-1的耐藥腸桿菌科細菌是臨床關注的焦點，因為其能表達多種藥物滅活酶，引起細菌多重耐藥，嚴重限制了臨床用藥［16］。此外，腸桿菌科耐藥菌株中IMP-1、IMP-2、VIM等的檢出預示B類碳青霉烯酶在臨床上的流行［17］。B類金屬酶對亞胺培南的水解作用是三類中最強的［7］，其又通過質粒擴散，引起產B類酶細菌的強耐藥性和多重耐藥，應該加強控制。（3）D類碳青霉烯酶：D類碳青霉烯酶中的OXA酶中只有少數類型對亞胺培南有水解活性，在耐藥腸桿菌科細菌中流行的主要為OXA-48樣碳青霉烯酶，其對亞胺培南具有很高的水解活性［12］。編碼OXA-48的基因通過質粒在腸桿菌科細菌之間傳播。目前國外發現了一種新型的OXA-48的衍生物OXA-162，bla OXA-162基因位于由兩個IS1999-2元件組成的攜帶轉座子的質粒上，其能夠提高對亞胺培南的水解活性［18］，這是酶發生變異后，提高原有活性的又一個例子。

2.2 膜孔蛋白的丟失與改變 革蘭陰性桿菌的細胞膜中鑲嵌著膜孔蛋白，允許大多數抗菌藥物跨膜進入菌體，影響著細胞膜的通透性。細胞膜的通透性與酶的作用共同影響著耐藥效益。肺炎克雷伯菌與亞胺培南耐藥有關的膜孔蛋白主要為OmpK35和OmpK36，其作用相當于大腸埃希菌的OmpF和OmpC［19］，若這兩種膜孔蛋白表達下調或者功能改變，會降低藥物的抑菌作用。Ye等［19］用SDS-PAGE發現耐藥的腸桿菌科細菌與敏感菌株相比Omp蛋白下調。最近，韓國學者［20］通過 ERIC-PCR分析，發現在所有亞胺培南耐藥的腸桿菌科細菌中，膜孔蛋白ompK35基因的表達均下調。此外，也有研究［21］證明膜孔蛋白下調合并滅活酶產生也是腸桿菌科細菌對亞胺培南耐藥的影響因素之一。由此可見，OmpK35/36 膜孔蛋白表達的單獨下調或合并滅活酶的共同作用是腸桿菌科對亞胺培南的敏感度下降的重要原因之一。

2.3 主動外排作用增強 主動外排系統是存在于細菌中的一組能將菌體內藥物或其他物質排出體外的外排泵，能使達到作用位點的藥物濃度下降而產生耐藥性。其中，與腸桿菌科細菌耐碳青霉烯類藥物有關的外排泵主要AcrAB-ToIC系統。臨床分離的耐藥大腸埃希菌通過分析發現AcrAB-ToIC外排泵基因表達上調而膜孔蛋白表達下調，使膜通透性下降［22］。由此可見，細菌細胞膜對抗生素的通透性與外排作用是相對的，膜通透性下降合并外排作用增強會導致菌體內藥物濃度下降，細菌對藥物敏感性降低。但也有研究發現外排泵基因AcrB的表達上調與細菌對亞胺培南耐藥無關［20］。目前對于外排泵系統調控機制研究還不夠深入，需要進一步探索，以解決由于外排作用而導致的耐藥問題。

2.4 青霉素結合蛋白的改變 青霉素結合蛋白（Penicillin binding proteins，PBPs）是幾乎存在于所有細菌內膜的一組有催化功能的酶，其能參與合成細胞壁和維持細胞形態［23］。當抗菌藥物與PBPs結合后，會抑制PBPs的酶活性，引起一系列級聯反應，導致細菌死亡。

在腸桿菌科中，對大腸埃希菌的PBPs的研究開展的最早。目前已知的大腸埃希菌的PBPs有12種。亞胺培南主要與PBP2及PBP3結合，其與PBP2結合后使細菌的形態發生改變，最終細菌溶解死亡；與PBP3結合后，能抑制大腸埃希菌的分裂［23］。除此之外，也有研究認為大腸埃希菌耐藥與PBP5的改變有關［24］。因此，PBPs如發生突變，藥物與作用靶位結合的親和力下降，最終表現為細菌對抗菌藥物的敏感性降低。

除了上述機制在腸桿菌科細菌耐藥效益中的作用突出，另外，靶酶和競爭性靶酶底物合成上調、耐藥基因及生物被膜的產生等也會影響細菌耐藥［25-26］，但這些機制中有關亞胺培南耐藥的腸桿菌科細菌的研究目前還不多，需要未來更加努力的探索。

3 耐藥對策

3.1 抗生素的使用管理 耐藥性的產生和變化大多起因于抗生素的濫用［12］。濫用抗生素使細菌發生變異，最終導致耐藥性的產生和傳播。細菌的耐藥檢測可以為臨床抗生素的使用提供可靠的數據，因此加強耐藥檢測，合理利用抗生素便顯得尤為重要。對于多重耐藥菌［27］，更要注重控制院內感染和交叉感染的發生，如發生則要及時隔離患者、加強院內環境衛生、做好院內人員個人衛生宣傳等減少耐藥菌感染的流行。

3.2 聯合用藥 有研究發現［28］，有些既有抗菌藥物同其他抗菌藥物聯合使用，治療效果明顯優于其單藥治療效果，如多粘菌素、磷霉素等，與其他抗菌藥物一同使用時，可明顯增強抗菌活性，延緩耐藥菌的出現。雖然大多研究認為［28-29］使用聯合治療耐碳青霉烯類藥物的腸桿菌科細菌效果優于單藥治療，但仍需進一步的研究驗證。

3.3 新藥研發 研發新型藥物治療感染勢在必行。目前已證實［29］有效的耐碳青霉烯類藥物的腸桿菌科細菌新藥主要有碳青霉烯酶抑制劑復方制劑、甘酰胺環素、新型頭孢菌素等，這幾類藥物主要通過抑制細菌蛋白合成、抑制酶產生、抑制細菌細胞壁合成等機制發揮抗菌作用。新藥的研發不僅可以從這幾方面繼續深入研究，也有望從改變藥物作用靶位或使用脂質體作為藥物載體等方向進行研究，以避免外排作用等因素對藥效的影響。

外排泵抑制劑能降低外排泵基因的表達，在一定程度上增加抗生素的敏感性，達到治療的目的。目前有關治療耐亞胺培南的腸桿菌科細菌感染的外排泵抑制劑的研究不多，國內外已知外排泵抑制劑主要有三酸鹽、維拉帕米等［30］，但由于該類藥物使用劑量對身體的副作用大，并未成功應用于臨床。有研究證明［31］連翹酯苷B對治療外排泵介導的細菌耐藥也有效，因此可以從中藥入手，充分發揮中藥對于機體的調理作用，探索新的治療途徑。

4 展望

腸桿菌科細菌對于亞胺培南的耐藥性有地區差異性，但在世界范圍內總體呈上升趨勢。腸桿菌科細菌耐亞胺培南的機制不是單一的，是多種機制間相互作用的結果，如細菌膜孔蛋白合成下調合并滅活酶的產生、細菌膜通透性下降合并主動外排作用增強或青霉素結合蛋白親和力下降等。同時細菌產生的滅活酶可以發生變異，一些變異體的產生加強了細菌的耐藥性，其能通過質粒在菌株傳播，加速耐藥性的擴散。腸桿菌科細菌耐藥性的擴散以及新藥研發緩慢，給臨床帶來困難，展望未來，通過對腸桿菌科細菌耐藥性研究的深入，研究者們會發現更多安全有效的策略來解決腸桿菌科細菌耐藥的問題。