血清μE3 βHCG hAFP聯合無創DNA產前檢測在胎兒染色體非整倍體產前篩查中的應用

胡振儀 朱清華

染色體非整倍體異常是指細胞中因某條染色體增多或減少而形成的數目異?，F象，是造成胎兒出生缺陷的原因之一，其中帕陶氏綜合征（13-三體）、愛德華氏綜合征（18-三體）、唐氏綜合征（21-三體）、性染色體異常均是臨床常見的較為嚴重的染色體非整倍體異常疾病［1］。目前，臨床針對染色體非整倍體異常疾病的治療尚處于無法治療或難以治療階段，多以預防為主，產前診斷尤其是孕早期篩查是避免缺陷胎兒出生的主要手段［2］。以往產前診斷常用的方法有羊水穿刺、絨毛取樣、血清學篩查等，其中羊水穿刺、絨毛取樣具有較高的篩出率、但該類操作具有侵入有創性，會對胎兒帶來一定風險；而血清學檢查雖較為安全，但其假陽性率較高，其臨床應用均存在一定局限性［3］。近年來，利用孕婦外周血中少量的胎兒DNA進行產前診斷已成為非侵入產前檢測的新方向，并取得較大突破［4］。本研究擬通過血清學檢測篩查出高風險孕婦，對其進行游離DNA無創產前檢測，并對結果異常的孕婦進一步進行羊水穿刺檢查，最終以羊水結果和妊娠結局作為金標準，分析血清學篩查聯合胎兒DNA無創產前檢測在胎兒染色體非整倍體產前篩查中的應用價值，以期為臨床篩查提供參考，具體結果如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2015年4月至2017年3月孕周為15～20+6周在浙江省新昌其婦幼保健計劃生育服務中心進行血清學游離雌三醇（Free estriol，μE3）、β-人絨毛膜促性腺激素（β-human chorionic gonadotropin，βHCG）、人血清甲胎蛋白（Human serum alpha-fetoprotein，hAFP）水平三聯篩查的孕婦5822例作為研究對象，孕婦年齡22～35歲，平均（30.06±3.25）歲。納入標準：（1）孕周＞15周者。（2）單胎妊娠者。（3）行正常產檢，資料記錄完整者。（4）本研究知情并簽署同意書者。（5）均隨訪至引產或分娩者。排除標準：（1）非自然受孕者。（2）孕婦自身為染色體異常。（3）惡性腫瘤患者。（4）孕婦近期有接受移植手術或干細胞治療。

1.2 方法 （1）血清學μE3、βHCG、hAFP水平三聯篩查：清晨空腹采集孕婦外周靜脈血3ml于抗凝管中，3500rpm離心10min，進行μE3、βHCG、hAFP三聯篩查，孕周為15～20+6周。采用Multicalc軟件結合孕婦年齡、體質量、末次月經、是否使用胰島素等計算高位孕婦的風險分割值，軟件輸入中對于月經正常的按孕周算，月經不正常的按雙頂徑算。其中21-三體綜合征的風險分割值為1/270，18-三體綜合征的風險分割值為1/350，均以超過風險分割值為高風險；單項指標的正常參考值為μE3≥0.7 MOM，βHCG在 0.25～2.5 MOM 中間，hAFP參考范圍為 0.65～2.5 MOM。血清篩查高風險的孕婦進行無創DNA產前檢測，低風險的孕婦繼續進行常規孕期檢查。（2）無創DNA產前檢測：選取血清學篩查顯示高風險的孕婦在15～20孕周采用Streck管收集外周血10 ml，通過兩次離心（1600g、4℃離心10 min）分離孕婦外周血，采用磁珠法提取血漿中的胎兒游離DNA，對提取的DNA片段的末端進行補平，通過接頭連接、文庫純化等方法建立樣品文庫，采用熒光定量PCR對文庫濃度進行控制，合格后采用北京貝瑞和康公司的Nextseq CN500測序儀進行上機測序，采用生物信息學軟件對測序結果進行分析，獲取染色體所占比例Z值，計算公式為Z值=（待測樣本目標染色體占整個基因組的百分比-正常組目標染色體占整個基因組的百分比的平均值）/正常組目標染色體占整個基因組的百分比的標準差，以Z值絕對值為3時作為風險截斷值，＞3即認為是染色體非整倍體高風險孕婦。對篩查結果為高風險的孕婦需進一步進行產前侵入性診斷。（3）核型分析：選取無創DNA產前檢測顯示為高風險的孕婦，于孕17周后在B超引導下采用穿刺針經腹壁進行羊膜腔穿刺抽取羊水，并對羊水細胞進行培養，采用G顯帶技術對胎兒染色體進行核型分析。

1.3 隨訪 根據孕婦產前檢測情況，核型分析顯示為染色體非整倍體異常的患者進行引產終止妊娠，其余孕婦隨訪至分娩。

2 結果

2.1 血清學三聯查篩查結果 5822例孕婦經血清μE3、βHCG、hAFP三聯篩查，篩出高風險241例（4.14%）；其中高風險孕婦中21-三體高風險孕婦196例（3.37%）、18-三體高風險孕婦27例（0.46%），其它18例（0.31%）。

2.2 無創DNA檢測結果 對血清三聯查顯示具有高風險的孕婦241例進行無創DNA檢測，結果顯示檢測值Z值＞3的有23例，其中21-三體陽性19例（0.33%）、18-三體陽性3例（0.05%）、13-三體陽性1例（0.02%）；其余檢測結果正常的218例孕婦隨訪至胎兒出生，隨訪結果顯示胎兒均無染色體異常。

2.3 染色體核型分析 23例無創DNA檢測篩查陽性病例均在孕婦及家屬同意的情況下，經羊膜腔穿刺區穿刺獲得羊水后進行胎兒核型分析，結果顯示22例（0.38%）患者存在染色體非整倍體異常，對其進行引產終止妊娠，另外1例核型未發現異常分娩后顯示胎兒染色體正常。

2.4 血清學篩查與無創DNA檢測結果比較 無創DNA檢測篩查出21-三體陽性、18-三體陽性、13-三體陽性所占血清學三聯合篩查高風險結果的9.69%、11.11%、5.56%，整體占高風險篩查人數的9.54%。

2.5 無創DNA檢測與核型分析結果比較 無創DNA檢測篩查出21-三體陽性、18-三體陽性、13-三體陽性與核型分析結果的一致率分別為94.74%、100.00%、100.00%，整體一致率為95.65%。

3 討論

出生缺陷是指胎兒在發育過程中出現的解剖學或功能學上的異常，主要包括先天性畸形、先天性智力低下、代謝障礙性疾病等［5］。目前研究顯示導致出生缺陷的原因較為復雜，多由環境因素和遺傳因素交互作用引起，其中染色體異常是常見的遺傳因素。孕期胎兒非整倍體染色體異常常導致死胎、死產甚至圍生期死亡等不良妊娠，即使胎兒存活下來也患有先天性結構發育異常或功能缺陷，生存質量相對較低，對母體造成沉重心理打擊的同時對家庭亦帶來沉重經濟負擔［6］。目前，臨床針對染色體非整倍異常的認識相對較淺，尚無明確有效的治療手段，因此在孕期對胎兒染色體非整倍體異常進行篩查是預防缺陷胎兒出生的最佳方法。相關研究報道顯示，孕中期是檢測胎兒染色體異常的最佳時機，該階段染色體異常篩出準確性較高，但以往臨床常用的金標準檢測手段主要為羊膜穿刺、臍靜脈穿刺、絨毛活檢等侵入性產前診斷，易增加孕婦流產或胎兒感染的發生風險［7-8］。因此，尋找同等有效但安全性高的非侵入性檢測手段成為臨床研究重點關注的問題之一。

母體血清學篩查方案是隨著μE3、βHCG、hAFP等與胎兒染色體異常相關的標志發現而建立的，目前國內用于妊娠中期的產前血清學篩查主要包括二聯查（μE3+βHCG）和三聯查（μE3+βHCG+AFP），其中三聯標志物篩查方法的檢出率相對高于二聯標志物篩查［9-10］。本研究首先采用三聯查方案對常規體檢孕婦進行篩查，結果同樣顯示產前血清學三聯查篩出21-三體高風險、18-三體高風險及其他高風險孕婦的檢出率分別為3.37%、0.46%、0.31%，后經無創DNA分析顯示染色體非整體異常病例占高風險篩查人數的9.54%，說明血清學篩查在染色體非整倍體異常的風險評估中具有較高價值，能夠明顯提高染色體異常的產前篩查效率。但該方法受孕婦自身條件的限制較多，臨床篩查時假陽性率和假陰性率均較高，臨床多作為輔助診斷方案與其它方案進行聯合篩查。

另外，對血清學篩查顯示高風險的孕婦采用無創DNA檢測后21-三體、18-三體及13-三體陽性的檢出率為9.69%、11.11%、5.56%，后經羊膜腔取羊膜細胞進行核型分析后顯示無創DNA檢測結果與核型分析結果在染色體非整倍體篩查時的一致性為95.65%，且對DNA檢測正常結果進行隨訪，胎兒出生后均無染色體異常，假陰性率為0%，說明無創DNA檢測在診斷準確率方面遠高于血清學三聯合篩查，且樣本采集較傳統侵入性檢測更為方便安全，在胎兒染色體非整倍體診斷中具有較高的可行性。但無創DNA檢測的成本約為血清學篩查的10倍左右，不適用于孕婦常規產檢的大樣本篩查；同時Syngelaki等［11］指出無創DNA檢測在診斷21-三體、13-三體及18-三體3種染色體異常的診出靈敏度可達100%，但遺漏了其它染色體數目或結構異常，不能用于檢測染色體非平衡易位或缺失重復的異?，F象，因此其在臨床并不能完全替代血清學檢查和絨毛膜絨毛取樣檢查或羊水檢測等侵入性檢查。

綜上所述，產前胎兒染色體非整倍體異常篩查應采用血清學（μE3+βHCG+AFP）三聯查方案、胎兒游離DNA無創檢測、羊水細胞核型分析等多種診斷技術的聯合，取長補短，在最大限度降低篩查工作量和篩查成本的基礎上提高染色體非整倍體的檢出率，降低胎兒出生缺陷的發生率。