載脂蛋白E與缺血性腦卒中的相關性研究進展

劉文婷 張卓伯

載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)是血漿脂蛋白的重要組成成分，在控制脂蛋白和膽固醇代謝的平衡中發揮重要作用。ApoE具有基因多樣性(ε2、ε3、ε4)，形成具有不同結構及功能的6種亞型。研究證明，ApoE在多種疾病中承擔重要角色，與動脈粥樣硬化、冠心病及神經系統多種疾病密切相關。目前有許多研究表明ApoE4極有可能為缺血性腦卒中的危險因素，但受限于多種干擾因素，結論卻也不盡相同，故有待進一步的研究，本研究就載脂蛋白E與缺血性腦卒中的關系和可能的作用機制進行綜述。

腦卒中是導致神經系統殘疾和死亡的首要原因。缺血性腦卒中是由血管、環境、遺傳等多因素共同作用的疾病[1]。其中，載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因是被廣泛研究的基因之一，主要集中在動脈粥樣硬化、冠心病、腦卒中等心腦血管疾病。ApoE基因包括3種等位基因(ApoEε2、ApoEε3、ApoEε4)，編碼3種蛋白質亞型(ApoE2、ApoE3、ApoE4)，形成6種遺傳表型，其中最常見遺傳表型為ε3/ε3，出現在人群中的頻率為1/3～1/2[2]。不同ApoE蛋白質亞型與脂蛋白受體可產生不同作用。在肝內它們通過不同的結合、攝取和分解乳糜微粒，從而改變膽固醇以及極低密度脂蛋白(VLDL)的水平。其中，ε4等位基因攜帶者有較高的血漿膽固醇水平，而ε2等位基因攜帶者膽固醇水平較低[2]，所以ApoE不同基因型可能影響動脈粥樣硬化的發展。據此本研究可以猜想，ApoE是否與缺血性腦卒中等腦血管疾病也有著密切的關系，本研究專注于載脂蛋白E與缺血性腦卒中的相關性研究進展。

1 ApoE和ApoE基因

載脂蛋白為血漿脂蛋白的蛋白質部分，主要分為A、B、C、D、E五類，載脂蛋白在血漿脂蛋白中起著重要作用，即它控制著脂蛋白代謝和膽固醇的平衡。載脂蛋白E(ApoE)被確定為脂蛋白關鍵成分的時間較晚。在20世紀70年代初ApoE首次被描述為極低密度脂蛋白(VLDL)中的次要載脂蛋白。隨后在高膽固醇飲食喂養動物實驗中載脂蛋白E被確定為β-VLDL中的主要載脂蛋白，并且不同亞型的高密度脂蛋白(HDL；HDL1，HDLc)也富含載脂蛋白E[3]。 起初該蛋白被稱為富含精氨酸的載脂蛋白[3]，在1982年被稱為ApoE[3]。

人類ApoE基因位于19號染色體長臂上，像許多可溶性載脂蛋白一樣，載脂蛋白E基因含有4個外顯子和3個內含子[4]，其中外顯子編碼的DNA序列存在多態性，即編碼112位半胱氨酸(cysteine，Cys)和158位精氨酸(Arginine， Arg)，這導致了3個等位基因的出現[5]，它們在人群中出現的頻率為(ε2,5%～10%、ε3,65%～70%、ε4,15%～20%),并且可以產生三種純合子遺傳表型(ApoE2/2,ApoE3/3,ApoE4/4)及三種雜合子遺傳表型(ApoE3/2,ApoE4/2,ApoE4/3)。三種基因型的結構基礎是112位和158位氨基酸不同(ApoE基因的單堿基變化)：ApoE2在112位和158位都編碼Cys，ApoE3在112位編碼Cys而158位編碼Arg，ApoE4在2個位上均為Arg[3]。包括類人猿在內的其他所有動物都只有單一異構體，即在殘基112位和158位上均為精氨酸[3]。

血漿載脂蛋白E主要由肝細胞合成，占人體產生的載脂蛋白E總量的75%。在血脂正常的人體中載脂蛋白E的血漿濃度為4～8 mg/dl[3]；其次ApoE由大腦合成，主要是由星形膠質細胞產生，但也可以由少突膠質細胞、小膠質細胞和神經元產生，特別是受損或緊張的神經元[6]。在大腦中載脂蛋白E是原位合成而不是從外周循環穿過血腦屏障而來。體內的各種細胞包括巨噬細胞也可合成載脂蛋白E[3]。

1.1 ApoE亞型的結構與功能

ApoE是一種由299個氨基酸組成的34 kDa蛋白質，在194位上的蘇氨酸(Threonine，Thr)處有1個糖基化位點[4]以及2個由鉸鏈區分開的結構域。 其中氨基末端結構域含有低密度脂蛋白(LDL)受體結合區，羧基末端結構域含有脂質結合區[7]。通過X射線晶體學解析，ApoE2，ApoE3和ApoE4的氨基末端結構域的三級結構由4個反平行排列的螺旋構成，羧基末端結構域具有與脂質結合的兩親α-螺旋[8]。

ApoE3和ApoE4以相似的親和力與LDL受體結合(比另一種LDL受體配體ApoB100高約20倍)。通過點突變和III型高脂蛋白血癥患者中天然存在的受體缺陷，確定了受體結合的關鍵氨基酸[8]。ApoE是通過介導VLDL、中密度脂蛋白和乳糜微粒殘留物的攝取在調節膽固醇穩態中起作用[3]。在ApoE2中158位編碼Cys，而在ApoE3和ApoE4中在158位為Arg，所以ApoE2與LDL受體結合缺陷(大約為正常活性的2%)。通過氨基末端結構域的X-射線晶體學所示，158位編碼的Cys通過改變136～150位堿性殘基側鏈的構象來阻止其與正常受體結合。在ApoE3中158位的Arg與154位的天冬氨酸(Aspartic acid，Asp)形成鹽橋，然而在ApoE4中因為158位為Cys，不能與154位的Asp相互作用，所以鹽橋被破壞，從而改變了整個受體結合區[8]。

ApoE4在112位編碼的Arg使61位上的Arg的側鏈遠離氨基末端結構域，112位編碼的Arg便可與255位的谷氨酸(glutamic acid,Glu)羧基末端結構域相互作用,這種特性為ApoE4的結構域相互作用[3]。在ApoE3或ApoE2中發生這種結構域相互作用的可能性較小，因為在這些異構體中61位上的Arg的側鏈更多地位于氨基末端的螺旋結構域[8]。但是這種結構域相互作用不是1個全或無的過程，其蛋白質的結構是動態變化的，所以ApoE在結構域相互作用上可能具有一定的梯度傾向(ApoE4>ApoE3>ApoE2)[3]。

1.2 ApoE與動脈粥樣硬化

1.2.1 ApoE2

因為ApoE2與LDL受體結合缺陷，所以ApoE2純合子可導致III型高脂血癥。在糖尿病、肥胖、甲狀腺功能減退或雌激素缺乏患者體內VLDL生產過盛或LDL受體減少，并且超出了ApoE2介導清除甘油三酯和β-VLDL的能力，也會出現類似情況。ApoE其他顯性和隱性突變影響受體結合區域內及其附近的殘基，也可導致III型高脂血癥[8]。在環境或遺傳因素的作用下受體的結合缺陷可誘發高脂血癥，并且增加動脈粥樣硬化的風險，尤其在外周動脈β-VLDL在血漿中的累積導致膽固醇濃度升高及重度動脈粥樣硬化。

1.2.2 ApoE4

ApoE4增加血漿中LDL的水平及動脈粥樣硬化的風險[3]。一方面ApoE4優先與大分子脂蛋白(30～80 nm)結合(如富含甘油三酯的VLDL)，而ApoE2、ApoE3則優先結合小分子脂蛋白(如富含磷脂和表面蛋白9～16 nm的球形HDL顆粒，載脂蛋白AI)；另一方面在肝臟高濃度的VLDL與ApoE4通過受體介導的內吞作用加速了它們的清除。因此，LDL受體減少，導致血漿中LDL水平增加[9]。

由240-260位上的羧基末端結構域介導的脂質結合過程中ApoE4中112位的氨基末端結構域Arg與ApoE3、ApoE2中的Cys不同，這種氨基酸的差異通過結構域相互作用改變ApoE4的脂蛋白親和力。ApoE4是通過小分子阻止Arg-61-Glu-255離子相互作用或定點誘變(61位的Arg變為Thr)，使結構域相互作用中斷，從而使ApoE4的結合從VLDL轉移到HDL[3]。Nguyen等人的研究證明ApoE4結構域相互作用與磷脂結合能力降低有關，因為結構域相互作用可以穩定延伸的螺旋結構，使其既能夠與較大的VLDL相互作用又可以與較小曲率的脂蛋白顆粒的相互作用[10]。

2 缺血性腦卒中

缺血性腦卒中是全球死亡和殘疾的主要原因之一[11]。過去認為其危險因素包括血脂異常、高血壓病、房顫、吸煙、糖尿病等，這只能解釋一小部分的觀察臨床事件。然而，很大一部分缺血性腦卒中患者的危險因素仍然不明。雙胞胎和家族聚集性研究表明，腦卒中的風險有很大的遺傳因素[12]。但由于缺血性腦卒中的發病機制尚未完全明確，且檢測候選基因的方法限制了發現新易感基因的能力，所以在一般人群中風險基因仍未確定。近年來研究表明，ApoE4似乎因擾亂了脂代謝平衡尤其是影響甘油三酯、膽固醇及LDL的水平而增加冠心病的風險，故ApoE與缺血性腦卒中的關系引起了熱議，并展開了一系列的研究。

3 ApoE與缺血性腦卒中

來自大型薈萃分析的證據表明，ApoE與冠心病(CHD)呈正向劑量-反應相關，與觀察到的LDL結果一致，支持LDL在CHD中的因果作用。然而，ApoE與缺血性腦卒中風險之間的相關性尚不清楚，不能從CHD相關性中推斷出來，只有1個ε4等位基因與缺血性腦卒中高風險相關的初步證據[13]。此外，該分析僅基于ε2和ε4基因攜帶者，而基于六種ApoE基因型的分析需要估計基因型劑量-反應關系。本研究可以通過ApoE與頸動脈內膜中層厚度(C-IMT)的關聯性及C-IMT與缺血性腦卒中的關系，在隨機試驗中采用無創測量動脈粥樣硬化當作替代結果[14]，從而分析ApoE與缺血性腦卒中的相關性。

3.1 ApoE與缺血性腦卒中(IS)的研究進展

ApoE基因與腦卒中的相關研究報道了一些積極的結果，如由Banerjee等人進行的研究顯示在統計學上ApoEε4等位基因與腦卒中顯著相關[13]。同樣，在中國人群中的研究表明ApoEε4增加患進展性腦卒中的風險[15]，并且關于中國北方的漢族人的研究表明高血壓病和ε2、ε3、ε4三種等位基因是缺血性腦卒中發病風險的獨立危險因素[16]。然而，關于廣西漢族人群的研究結果表明ApoE基因多態性與缺血性腦卒中無顯著的關系。但是，隨后的研究顯示，一些基因表型具有顯著相關性，如ε2/ε4與ε3/ε3，ε3/ε4與ε3/ε3，ε4/ε4與ε3/ε3以及等位基因ε4與等位基因ε3[17]。目前研究證明，雖然一些特定的基因表型(ε2/ε2與ε2/ε4，ε3/ε3與ε2/ε3，ε3/ε3與ε2/ε4，ε4/ε4與ε2/ε3，ε4/ε4與ε2/ε4)和基因型(ε3與ε4)與缺血性腦卒中無明確相關，但與出血性腦卒中患者有重要聯系，并且研究發現缺血性腦卒中與出血性腦卒中在一些基因表型(ε2/ε2與ε2/ε4，ε3/ε3與ε2/ε3，ε3/ε3與ε2/ε4，ε4/ε4與ε2/ε3，ε4/ε4與ε2/ε4)上有明顯差異[1]。

有關ApoE基因與缺血性腦卒中亞型關系的相關研究發現其與顱內大血管閉塞、腔隙性腦梗死和心源性腦卒中(CE)顯著關聯[1]。關于臺灣人群的調查顯示ε3/ε4基因型與腔隙性腦梗死可能相關，但是與動脈粥樣硬化性血栓性腦梗死卻無明顯相關[18]，并且有關日本人群的研究表明ε2等位基因攜帶者具有動脈粥樣硬化血栓形成、腦出血(ICH)和心源性腦栓塞的危險因素，并且ε4等位基因攜帶者患動脈粥樣硬化血栓形成、腦出血和蛛網膜下腔出血(SAH)的風險較高[19]。

綜合以上的研究發現，由于缺血性腦卒中分型較多，危險因素復雜，且不同種族差異較大，故ApoE基因與缺血性腦卒中的關系不易確定。大量研究表明在亞洲人群中ApoEε4等位基因極有可能是缺血性腦卒中的危險因素。

3.2 ApoE與缺血性腦卒中的可能作用機制

為了明確ApoE影響缺血性腦卒中的作用機制，大量研究其可能與之相關的因素，其中包括血脂、炎癥、內皮細胞活化以及代謝。

載脂蛋白E的結構和受體結合特性可能對腦血管系統產生強烈的影響。如外周產生的ApoE可以向大腦內皮細胞(brain endothelial cells，BEC)發出信號，并且神經血管單元(neurovascular unit，NVU)的細胞可以表達ApoE和ApoE受體。大量研究表明ApoE亞型特異性差異影響蛋白質折疊包括受體結合結構域(氨基末端)和脂質結合結構域(羧基末端)以及ApoE的穩定性[20]。在中樞神經系統大腦間質液中大部分ApoE是以脂蛋白的形式存在，而ApoE異構體之間的差異將影響脂蛋白的結構。Tai等人的研究提出假設，認為腦中的ApoE亞型之間的結構差異導致ApoE4具有較低的脂化作用，ApoE4-脂蛋白穩定性較低，產生有毒的ApoE4片段，降低ApoE4水平，導致ApoE4細胞再循環受損和受體活性改變[21]。

針對腦血管系統，ApoE特異性調節星形膠質細胞-周細胞-大腦內皮細胞的相互作用。在周細胞中ApoE4(來源于星形膠質細胞)向低密度脂蛋白相關受體蛋白1(LRP1)傳遞信號受損，從而導致周細胞中親環蛋白A(cypA)及NFkB-基質金屬-蛋白酶9(MMP9)途徑的高活性[22]。MMP9水平的升高，通過基底膜降解和腦內皮細胞功能受損，導致腦血管形成功能障礙。重要的是，ApoE異構體通過LRP1和RhoA途徑特異性調節周細胞運動。由大腦分泌的ApoE可以激活大腦內皮細胞中的ApoE受體來調節腦血管功能，這一作用總是被忽略。事實上，在大腦內皮細胞中因為ApoE3的作用比ApoE4更大，所以來源于星形膠質細胞的ApoE經LRP1通路導致了ApoE4的蛋白磷酸化降低[23]。除了激動劑活性之外，在血管性癡呆中觀察到的毒性ApoE4片段在腦內皮細胞內的積累也可誘導腦血管功能障礙。因此，與星形膠質細胞、周細胞和腦內皮細胞中的ApoE3相比，ApoE4受體信號級聯反應可能會變慢，從而導致腦血管破壞。

廣泛研究認為，ApoE4與Aβ非依賴性神經炎癥和Aβ依賴性神經炎癥的有害反應相關[24]。然而，由于慢性神經炎癥的復雜性，包括時間特異性和細胞特異性發生的多種有害和有益的效應，幾乎使每種炎性介質的功能數據相互沖突，而ApoE4誘導的有害神經炎癥表型，其特征在于高濃度促炎細胞因子和低濃度抗炎細胞因子[24]，并且許多炎性介質在腦血管系統(腦血管內皮細胞功能、血管生成和基底膜)中起到了重要的作用。ApoE4引起腦血管損傷一部分是通過上述的ApoE信號傳導來介導對神經膠質炎癥的作用，一部分ApoE是通過對腦內炎性細胞釋放的可溶性介質的作用，從而抵御外界的打擊[23]。

4 機遇與挑戰

近年來隨著各種科學技術的不斷提高，人類對ApoE基因的研究愈發的深入，證明了從動脈粥樣硬化、冠心病到神經系統疾病等眾多疾病都和ApoE基因多樣性有著密切的關系。ApoE基因的研究經歷了漫長的過程，也產生了許多學說，尤其在ApoE基因與腦卒中方面，但至今尚無統一確定的答案。隨著對ApoE基因研究的不斷深入以及聯合其他科學新技術的應用，ApoE基因對腦卒中的影響以及機制將得到更加科學的解釋，并且以期能夠在腦卒中的預防、診斷及治療中發揮重要作用。