肝纖維化的發生機制及其診療研究進展

付洪彥 龔作炯

1.十堰市丹江口市第一人民醫院感染科 (湖北 丹江口， 432799) 2.武漢大學人民醫院感染科

肝纖維化是終末期肝病發生的基礎，因此，深入肝纖維化發病機制研究，做出肝纖維化早期診斷并采取適當治療措施，對各種慢性肝病治療及預后改善具有重要的臨床意義。本文將結合最新的研究，從肝纖維化的發生機制，診斷方法及治療的研究進展作一綜述。

1. 肝纖維化的發生機制

肝纖維化的發病機制異常復雜，肝星狀細胞(HSC)是肝纖維化發生的細胞學基礎[1]，另外各類細胞、細胞因子、miRNA等也參與了肝纖維化發展過程。

1.1 纖維化的形成 肝纖維化是細胞外基質(ECM)在肝內過量沉積，匯管區大量纖維組織異常增生的過程，其破壞了肝臟正常組織學結構，是各種慢性肝病向肝硬化發展共有的病理改變和必經路徑。肝纖維化是肝硬化的前期階段，其病理改變可逆。HSCs對肝纖維化起著舉足輕重作用，HSCs激活和轉化為肌成纖維細胞(MF)是纖維化發生發展的核心。HSCs和肌成纖維細胞具有快速增殖、遷移，收縮性等特征。與此有共同特征的活化膽管細胞也是纖維化發生的重要驅動因子。肝纖維化形成除了由于上調ECM各組分的合成和沉積，還與HSC/MF和Kupffer細胞/巨噬細胞使金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP-1)的合成增加，纖維化金屬蛋白酶(MMP)的生成減少，從而造成纖維溶解受阻也有關。肝纖維化是一個細胞外基質生成與降解的動態平衡過程，在肝臟疾病的早期，肝纖維化的形成伴隨著纖維溶解的上調(蛋白水解酶除去過量的ECM)，隨著損傷時間的延長，纖維形成多于纖維化降解，導致ECM過量沉積，伴隨著MMP分泌和活性的下調，以及MMP-1的組織抑制劑(TIMP)的增加[2～4]。當MMP的活化發生在錯誤的時間和位置可導致更多的組織損傷，促進纖維化發生。大部分ECM成分和一些MMP，TIMP-1和TIMP-2主要由活化的HSC或門靜脈MF產生[5～7]。Kupffer細胞/巨噬細胞、增殖性膽管上皮細胞和膽管細胞(祖細胞或卵圓細胞)、分泌細胞因子和生長因子的肌成纖維細胞可以誘導造成纖維形成的MF和HSC激活或進一步招募炎癥細胞。活化的膽管細胞已經作為纖維發生的重要驅動因素出現，這些具有肝祖細胞(卵圓)細胞特性的細胞可在各種病因所致的較嚴重的(分期 ≥ 2)肝纖維化中發現。它們產生中心纖維化介質，包括驅動MF/HSC增殖和或激活的轉化生長因子(TGF)-1，TGF-2，血小板衍生生長因子(PDGF)[8]。另一方面,活化HSC和MF產生膽管細胞存活因子使得纖維化膽管和門靜脈分支形成。這些促纖維增生性膽管細胞可以作為藥物研究的靶點，一個已經在臨床前得到驗證的靶點是膽管細胞/纖維原性祖細胞特異性整合素αvβ6，可通過抗體阻滯劑或小分子抑制劑來阻斷[9,10]，另一個目標是腫瘤壞死因子樣弱誘導凋亡作用的纖維化膽管上皮細胞生長因子TWEAK，可被人源性抗體阻滯劑中立化[11]。

1.2 纖維化形成可逆性 近年研究發現，HBV復制得到長期抑制以及HCV感染清除患者的代償期肝硬化仍然具有可逆性。這表明一旦肝臟主要疾病和肝纖維化發生刺激被消除，病情進展和纖維化會得到抑制，多數患者可從代償期肝硬化回到正常肝臟[12]。因此，免疫領域是一個抗纖維化研究熱點。正常肝臟有強大的的先天和適應性免疫應答，但在慢性肝病中受到抑制，慢性肝病中低水平的炎癥反應，實際上是纖維化形成的有利環境。在固有免疫細胞中，Kupffer細胞在纖維形成和纖維溶解中均起到重要作用。肝臟受到損傷后，Kupffer細胞能夠募集大量能夠迅速獲得巨噬細胞表型 CD11b + F4/80 +的Ly6Chi單核細胞等其他固有免疫細胞[13～15]。這些浸潤細胞能夠產生多種對HSC和MF具有強的促炎癥或直接促纖維化作用的細胞因子，例如TNFα、IL-1β、IL-13和TGFβ1。另一方面，肝纖維化逆轉過程中，巨噬細胞表現為纖維溶解的特征，上調MMP表達和Ly6 lo F4/80 +表型，減少TGFβ1的分泌。因此，針對促肝纖維化形成巨噬細胞這一靶點，通過趨化因子受體CCR2抗體或使用促肝纖維化形成巨噬細胞轉換為纖維溶解巨噬細胞方面的藥物是一個有吸引力的治療方向[16]。

2.肝纖維化的診斷

慢性肝病患者的分期和分級與肝纖維化的進展相關，因此明確其分期及分級并采取相應治療措施對慢性肝病患者尤為重要。雖然肝穿刺活組織病理檢查是一種有并發癥的侵入性手術，但目前仍是評估肝纖維化的“金標準”。在過去的十多年，已提出多種非侵入性替代方法在評估肝纖維化，包括分別與纖維發生和肝臟功能相關的纖維化的血清直接和間接標志物，以及測量肝硬度的儀器技術。盡管非侵性診斷方法的準確性研究最初集中在慢性丙型肝炎,現在有越來越多的數據表明他們可以應用于其他慢性肝病。雖然在特定的環境中,仍然有需要進行肝活檢，但非侵入性的方法在監控患者的纖維化進展的臨床實踐中起到越來越重要的作用。

2.1 肝穿刺活組織病理檢查 肝穿刺活組織病理檢查(肝活檢)不僅能評估肝纖維化的進展，并能為炎癥反應、壞死、脂肪變性等病變過程提供有用的信息。它還能夠識別和量化肝實質中的鐵和銅，識別疑似的輔酶因子和合并癥[17]。但肝活檢是種侵入性手術易造成出血、活檢部位的疼痛、感染和對附近器官的意外損傷等并發癥。一項研究報道了835名進行肝活檢的慢性肝病患者中，22%出現了不良反應，3.8%需要住院治療[18]。由于肝實質內的纖維化的組織學分布是異質的，肝穿刺活檢的標本僅代表總肝臟質量的1/50,000，因此，樣本的誤差可能影響肝活檢的準確性[19]。據估計，一個25毫米的活檢標本診斷錯誤率為25%,如果活檢組織長度小于15毫米則上升至35%[20]。Colloredo等人分析了樣品大小對慢性肝病患者肝纖維化的正確分期的重要性，指出肝活檢樣本的長度應至少為20mm，至少有11個完整的匯管區[21]。此外，觀察者之間的變異性也影響肝活檢評估纖維化的準確性，有高達30%的假陰性結果。因此，臨床上急需能夠精確測量肝纖維化程度的非侵入性方法。

2.2 非侵入性檢測方法 在過去的十年，肝纖維化的非侵入性的檢測一直是研究的熱門。開始時，主要關注點在于通過識別不太可能患有顯著纖維化的患者和極可能患有肝硬化的患者來減輕肝臟活檢的負擔。然后，可以相應地作出治療決定，中間的患者(灰色區病例)可以進行肝活檢或隨時間觀察。一般來說,肝纖維化的非侵入性的檢測可分為血清學檢測和物理測量。

2.2.1 血清學檢測 血清檢測的優點包括高適用性(在大多數情況下可以成功的檢測)和相對簡單的樣本運輸。血清測試可分為I類生物標志物和II類生物標志物。I類生物標志物能特異性地檢測纖維形成或纖維蛋白溶解的活性。相比之下，II類生物標志物不直接測量纖維化，而是呈現與纖維化相關的參數。比如，天冬氨酸轉氨酶(AST)是肝臟壞死性炎癥而非纖維化的標志物。然而，患有纖維化和肝硬化的患者通常具有增加的AST水平。雖然I類生物標志物有望直接反映纖維化和比第二類的生物標記物更準確，但這一結論還沒有在前瞻性研究中得到驗證。然而，目前沒有可以充分反映纖維化的單一的生物標志物。因此，在大多數情況下，幾個生物標記或生物標記聯合其他臨床特征來檢測肝纖維化。例如一些FibroTest，FibroMeter和增強的肝纖維化(ELF)評分的組合已經商業化用于肝纖維化檢測。應當注意，這種組合測試針對肝臟組織學建模，是不完美的參考標準。換句話說，即使模型可以100%忠實地反映肝組織學，肝組織學診斷纖維化和肝硬化的準確性將是新模型的準確性的上限[22]。一些II類生物學標志物，包括AST/ALT比率和AST與血小板比率指數(APRI)更為通用。由于不同肝臟疾病的病理生理學差異，II類生物標志物更具疾病特異性。例如,代謝因素引起的非酒精性脂肪肝肝纖維化評分只能應用于非酒精性脂肪肝患者[23,24]。

2.2.2 肝纖維的物理測量 肝纖維化的非侵入性檢測的另一個主要類型依賴于肝硬度和彈性的物理測量。雖然測量的臨界值是參考組織學確定的，這些測試并依賴于組織學建模，理論上可以實現比組織學更好的預測。

瞬時彈性成像FibroScan是目前最常用測量肝臟硬度的方法。對慢性病毒性肝炎患者的研究表明，在預測總死亡率時，瞬時彈性成像可能優于組織學[25]。它通過測量剪切波在肝實質的速度來估計肝纖維化(基于波在更硬的介質中速度更快的物理原理)。瞬時彈性成像主要的優點是易于使用和高再現性[26]。與血清學檢測相比，瞬時彈性成像不太適用于肥胖病人，盡管新XL探頭可以做出部分補償。肝硬度也受高ALT水平，肝臟充血，食物攝取和淀粉樣變性的影響。因為肝硬度和纖維化之間的相關性是一種普遍現象，所以該技術可以應用于具有不同肝臟疾病的患者[27]。聲輻射力脈沖和剪切波彈性成像等較新的技術，允許肝實質同時實現可視化和肝彈性的測量[28]。

計算機斷層掃描(CT)掃描已被用于探索肝實質提供關于顯著纖維化，肝硬化及其肝細胞癌和門靜脈高壓等并發癥的信息。僅能對非晚期的纖維化階段的患者進行有限評價。最近的一項前瞻性研究評估了增強CT區分CHC初治患者中最小和中度纖維化的效用，指出CT區分最小和中度纖維化靈敏度為71%，特異性為65%[29]。另一項評估肝臟CT圖像對CHC患者的纖維化診斷的研究報道CT診斷顯著纖維化(≥F2)和晚期纖維化(≥F3)的準確度分別為0.83和0.86[30]。然而,CT比目前在使用的其他非侵入性方法費用要高，此外，它使患者暴露于輻射和造影劑。

常規磁共振成像(MRI)技術對嚴重肝臟疾病肝形態學改變具有高度特異性，但對慢性肝病的早期階段靈敏度較低。然而，先進的MRI技術如磁共振彈性(MRE)可識別肝纖維化。該技術可以非侵入性地對肝纖維化進行定量，提供肝臟大區域上組織硬度的定量圖，而不是由TE提供的有限深度處的局部點測量[31]。MRE使用振動裝置來產生在肝臟中傳播的剪切波，通過改良的相位對比脈沖序列檢測剪切波，然后通過專用的計算機算法進行分析，以產生描繪組織硬度的彈性圖[32]。有研究評估了MRE檢測肝纖維化的準確性。一項50名慢性肝病患者和35名健康對照的研究，報道了MRE區分任何階段肝纖維化與正常肝組織的靈敏度為98%，特異度為99%。此外，MRE鑒別輕度纖維化患者與中度/重度纖維化患者的敏感性為86%，特異性為85%[33]。另一項前瞻性研究比較了141例慢性肝病患者的纖維化非侵襲性分期的MRE，TE和APRI測量診斷的準確性。作者報道，MRE比TE和APRI以及TE聯合APRI具有更高的診斷準確性[34]。MRE可以在肥胖患者中進行，不需要聲窗，并且可以在MRE的同時獲得常規MR。然而，由于對波浪可視化的干擾，它不能在患有中度至重度肝鐵過載的患者中進行。另外，MRE機器檢測費用昂貴限制了其在臨床中的廣泛應用。

3 肝纖維化治療

去除引起慢性肝病的主要病因是抑制纖維發生的最佳策略。然而，在許多慢性肝病中，往往主要致病因素或幾種相關因素并不能消除。此外，慢性肝病晚期疾病的逆轉，甚至在有效的治療下可能也不足以預防肝失代償、靜脈曲張、感染和HCC出血等并發癥的發生。這突顯出開發和臨床驗證抑制纖維化進展并誘導其消退的特異性抗纖維化藥物的重要性。

細胞表面蛋白細胞因子受體，整聯蛋白和鈣粘蛋白的N-糖基化受N-乙酰葡糖胺基轉移酶V(GnT-V)的影響，GnT-V的敲除可以抑制細胞遷移，因此，GnT-V有望稱為預防肝纖維化的治療靶點。研究者觀察到在誘導小鼠肝纖維化形成過程中，激活的HSC細胞中肝GnT-V纖維形成顯著增加伴隨著GnT-V的上調。他們發現敲除肝GnT-V導致纖維化肝中GnT-V的表達降低。他們得出結論，GnT-V與肝纖維化有關，因此，阻斷GnT-V可能是治療和預防肝纖維化的有效方法[35]。雖然已知改變GnT-V的表達可以調節多重細胞因子信號通路導致腫瘤侵襲和轉移，但其在肝纖維化發展中的作用仍然是相反的。

成肌纖維細胞轉分化(MTD)是肝纖維形成過程中的關鍵事件，并且在過去幾年中的研究已經鑒定了負責肝星狀細胞MTD的重要介質和分子機制。在脂肪細胞和HSC的分化之間存在調節機制，從脂肪形成向生肌或神經元表型的轉變表現為HSC MTD[36]。這種轉變的結果是脂肪形成調節劑過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的表達的喪失。PPARγ和/或其他成脂轉錄基因恢復表達可以將肌成纖維細胞、HSC逆轉成分化細胞。脂肪形成轉錄因子的表達對于維持體外HSC靜止是必需的。

Wnt信號通路在脊椎動物是同源基因其翻譯的蛋白質可以參與調節細胞增殖，細胞極性和細胞分化。在人肺纖維化，腎纖維化和肝纖維化等纖維化疾病中，Wnt信號傳導起核心作用。因此，使用共受體拮抗劑Dickkopf-1(DKK1)阻斷經典Wnt信號通路可阻斷這些表觀遺傳阻遏并恢復基因PPARγ表達和HSC分化。被認為是肝纖維化和肝再生的新型治療靶標。

上皮-間質轉化(EMT)的觸發器可以誘導器官纖維化和腫瘤轉移等病理問題。已經發現，膠原I通過一些轉錄因子表達的增加刺激EMT。這些因子改變上皮和間充質標記物的表達，引起EMT的啟動，刺激細胞遷移[37,38]。

整聯蛋白連接激酶(ILK)是一種普遍表達的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，涉及癌癥的發生，進展和轉移。ILK在膠質瘤細胞侵襲和遷移中的作用表明ILK被認為有潛在的治療作用。

EMT和ILK信號通路的調節在腫瘤進展中起重要作用。一項研究表明EMT參與膀胱癌的轉移，提出核糖核酸酶抑制劑(RI)可以抑制癌癥的發展，并通過調節EMT和ILK信號通路阻止膀胱癌轉移[39]。ILK在EMT和轉移中的決定性作用已經在結腸直腸癌(CRC)的情況中得到證實[40]。ILK和EMT信號通路可以為癌癥治療開辟新的機會。

4 結論

肝纖維化特征在于細胞外基質的過度沉積，發生在慢性酒精消耗，肝炎病毒，非酒精性脂肪性肝炎和遺傳疾病等各種病癥。慢性肝損傷刺激肝細胞，膽管上皮細胞，血小板，枯否氏細胞和其他炎性細胞產生介質時肝纖維化開始形成。它們使肝臟中的細胞分化成肌成纖維細胞。 肌成纖維細胞來源于HSC、膽管周成纖維細胞、肝細胞、膽管上皮細胞和骨髓來源的細胞。生長因子在該疾病的發生期間產生，其刺激肌成纖維細胞增殖，并且產生刺激這些細胞遷移到肝臟受損區域的趨化因子。一旦肌成纖維細胞在這些區域中累積，它們被刺激產生膠原和細胞外基質的其它組分。雖然肝纖維化的機理已經被確定，但是目前幾乎沒有直接預防或逆轉纖維化的治療藥物。因此，需要進一步的研究來確定治療這種疾病的新的、有效的治療靶點。

早期診斷和明確纖維化分期有助于減少危險和防止其發展肝硬化。目前，肝纖維化多種非侵入性的檢測，如分子標志物、影像學技術用于診斷評估纖維化的發展情況,同時,也為纖維化的診斷提供了大量的診斷信息,在臨床上若能將這幾種診斷方法結合起來,則能夠更有效準確地對纖維化進行診斷。

隨著纖維化發病機制的研究不斷深入，干預或逆轉纖維化的發生將會給臨床治療提供越來越多的治療靶點。