腺苷酸活化蛋白激酶在星形膠質細胞中的表達

師忠芳，徐立新，閆旭，董麗萍，袁芳

缺血性腦損傷的主要發生機制之一是能量代謝障礙，腦損傷后神經元利用葡萄糖產生三磷腺苷（adenosine triphosphate，ATP）能力減低，轉而由星形膠質細胞為其提供乳酸作為能量底物[1]。有研究發現谷氨酸抑制星形膠質細胞線粒體氧化磷酸化作用，增加有氧糖酵解產生乳酸[2]。腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphateactivated protein kinase，AMPK）是機體重要的能量感受器，AMPK激活后增加脂肪酸氧化和糖酵解[3]。大量研究顯示缺血性腦損傷后AMPK被激活對神經元產生重要影響[4-6]，AMPK在星形膠質細胞中的作用研究較少。AMPK由不同亞基形成至少12種異源三聚體發揮其生物學功能，但是星形膠質細胞中以何種三聚體存在沒有相關報道，本文擬利用培養的大鼠星形膠質細胞檢測AMPK各亞基的表達情況探討其在星形膠質細胞中的異源三聚體形式，為進一步深入研究AMPK在缺血性腦損傷的發生發展中的作用機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及試劑 新生1 d的Wistar大鼠由中國醫學科學院實驗動物研究所[合格證號：SCSK（京）2005-0013]提供。實驗過程按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷，并通過北京市神經外科研究所動物福利倫理審查（No.201401007）。最低必需培養基（minimum essential medium，MEM）（Gibco，Grand Island，NY，USA）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Gibco）、胰蛋白酶（Merck，Darmstadt，Germany）、兔抗大鼠膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）多克隆抗體（Dako Glostrup，Denmark）、小鼠抗大鼠S100β多克隆抗體（Abcam，Cambridge，UK）、Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG及Alexa Fluor 546標記山羊抗小鼠IgG二抗（Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）、含4'6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI）的熒光封片劑（中杉金橋）、EastepTM總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）提取試劑盒（Promega，Madison，WI，USA）、反轉錄試劑盒（Promega）、2×EasyTaq聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）SuperMix購自北京全式金生物技術有限公司，GoldViewTM核酸染料及脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）marker購自北京賽百盛基因技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養 大鼠星形膠質細胞原代培養參考McCarthy的方法并加以改良[7]，無菌條件下，取新生1 d的Wistar乳鼠大腦皮層組織，將其切割成約1 mm3小塊，吹打過濾后，接種于培養瓶中，置37℃、5%CO2培養箱，每3～4 d換液1次。原代培養約10 d后進行傳代培養，經過大約10 d進行實驗，GFAP和S100β免疫細胞熒光染色鑒定培養細胞純度。

1.2.2 GFAP和S100β免疫熒光染色 根據師忠芳已發表文獻的方法進行實驗[7]，培養細胞丙酮固定30 min，正常羊血清封閉15 min，加入兔抗大鼠GFAP抗體（1∶50），小鼠抗大鼠S100β抗體（1∶100），陰性對照用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗，4℃過夜。Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG及Alexa Fluor 546標記山羊抗小鼠IgG（1∶100）避光孵育3 h，含DAPI的熒光封片劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.3 反轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）法檢測AMPK各亞基表達 使用EastepTM總RNA提取試劑盒提取培養細胞總RNA，應用Promega公司反轉錄試劑盒合成cDNA，然后進行PCR實驗。按照GenBank大鼠AMPK各亞基序列進行引物設計（表1），由深圳華大基因科技服務有限公司合成。PCR反應體系包括：2×EasyTaq PCR SuperMix 10 μl，上游引物、下游引物各1 μl，模板cDNA 1 μl，無核酸酶的水7 μl，反應體系共20 μl。PCR反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸25 s，40個循環，72℃終延伸7 min。陰性對照為只加入引物不加入模板。整個PCR反應過程在PCR系統（美國Life Technologies，型號Proflex）內完成。PCR擴增產物在2%瓊脂糖凝膠中進行電泳，凝膠成像分析系統（美國Bio-Rad，型號 ChemiDocTMMP）觀察，拍照，分析AMPK各亞基的表達情況。該實驗分別在3次獨立培養的星形膠質細胞中進行。

表1 AMPK各亞基基因引物序列

2 結果

2.1 培養細胞形態觀察及免疫熒光染色 倒置相差顯微鏡下觀察星形膠質細胞呈大致均一的單層扁平細胞，具有短而粗大的細胞突起（圖1）。GFAP和S100β細胞免疫熒光染色顯示，培養細胞95%以上為免疫熒光染色陽性細胞（圖2）。

2.2 RT-PCR實驗 應用AMPK各亞基引物對細胞進行RT-PCR分析，凝膠電泳實驗結果顯示，陰性對照沒有出現任何條帶，在正常的星形膠質細胞中有AMPK α1、α2、β1、γ1及γ2亞基特異性目的條帶的出現，沒有AMPK β2亞基目的條帶的出現。在出現的5種目的條帶中，AMPK α1及γ2亞基目的條帶表達量相對較少，AMPK α2、β1及γ1亞基目的條帶表達量相對較多，結果提示AMPK α2、β1及γ1亞基構成的三聚體可能在星形膠質細胞能量代謝調節中發揮重要作用（圖3）。

3 討論

AMPK通過調節機體的能量代謝維持機體能量的供求平衡。星形膠質細胞對維持腦內能量代謝的穩定起重要作用。本實驗通過RT-PCR的方法發現在培養的大鼠星形膠質細胞中AMPK α2、β1及γ1亞基表達相對較多，AMPK α1及γ2亞基表達相對較少，AMPK β2亞基沒有表達，提示AMPK在星形膠質細胞中形成AMPK α2/β1/γ1三聚體。

星形膠質細胞是中樞神經系統內數量最多的一類細胞，在神經元的發育分化、修復再生、信號傳遞、突觸形成和消除、免疫調免疫調節、學習記憶和呼吸調節等方面具有重要生物學作用[8]。近年來對星形膠質細胞在各種腦疾病中的作用研究越來越多，尤其是缺血性腦損傷后星形膠質細胞對神經元的保護作用受到研究者關注[9-10]，但由于在體研究干擾因素較多，不能區別是原發損傷還是繼發損傷，利用體外培養星形膠質細胞進行疾病相關研究受到研究者重視。在本實驗中，我們利用新生大鼠進行星形膠質細胞培養，并使用GFAP[11]和S100β[12]進行鑒定證實培養細胞95%以上為GFAP和S100β免疫熒光染色陽性的星形膠質細胞。

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察培養大鼠星形膠質細胞（200×）

AMPK是1994年由Carling等[13]首次從細胞內提取并進行基因測序，當細胞內AMP水平升高或ATP/AMP比率下降時，AMPK即可被激活，進而促進糖原分解、糖酵解、脂肪酸氧化等分解代謝來增加ATP的生成，同時抑制糖原合成、脂肪酸合成等合成代謝，以減少ATP的消耗[14]。研究顯示，缺血性腦損傷后AMPK活化可產生神經保護作用[5，7，15-16]，但也有研究證實，腦組織中的AMPK活化是有害的[5，17-18]。AMPK在缺血性腦損傷病理生理學過程中的作用機制有待于進一步研究。

AMPK是由α、β和γ亞基組成的一種異源三聚體，每種亞基又由不同基因編碼形成不同的亞型。其中α亞基由2種基因編碼形成α1和α2，β亞基同樣由2種基因編碼形成βl和β2，而γ亞基由3種基因編碼形成γ1、γ2和γ3。α亞基作為催化亞基，β和γ亞基是調節亞基，γ亞基具有AMP結合位點，β亞基主要是起連接α和γ亞基的作用。現有研究顯示AMPK各亞基的組織、細胞和亞細胞定位以及各亞型的不同組合方式決定了AMPK在不同組織內的生物學作用。有研究顯示除AMPK γ3亞基外，其余各亞基均表達在腦內神經元[19]，本實驗利用培養星形膠質細胞研究發現，星形膠質細胞中有較多AMPK α2、β1及γ1亞基表達，提示在星形膠質細胞中AMPK由α2、β1及γ1亞基形成三聚體在其能量代謝調節中起重要作用。Turnley等[19]利用免疫組化的方法在星形膠質細胞檢測到AMPK α2亞基高表達，只在神經氈發現少量AMPK α1亞基表達，這與我們的結果是相似的。Li等[18]分別利用敲除小鼠AMPK α1和α2基因進行研究發現腦缺血再灌注損傷后只有AMPK α2基因的激活會加重腦組織損傷，AMPK α1基因無此作用。由以上結果推測，星形膠質細胞上的AMPK α2/β1/γ1三聚體極可能參與缺血性腦損傷的發生發展并在其中扮演重要角色。有文獻報道，AMPK β1亞基主要表達在腦內，對正常腦的發育是必需的[20]，在本次實驗中我們也檢測到了星形膠質細胞上AMPK β1亞基的高表達，推測其可能參與腦的發育。在本次實驗中我們沒有檢測到AMPK β2亞基的表達，有文獻報道AMPK β2亞基主要表達在骨骼肌中[21]。在我們的研究中發現星形膠質細胞上AMPK γ1亞基高表達，Turnley等[19]在實驗中通過免疫組化的方法沒有在星形膠質細胞中檢測到有AMPK γ1亞基的大量表達，這可能與實驗條件及檢測方法等有關。已有的研究顯示AMPK γ3亞基僅在骨骼肌細胞中可見[22]。由以上結果推測在星形膠質細胞中由AMPK α2、β1及γ1亞基所形成的三聚體的功能可能比較復雜，其在腦內能量代謝障礙相關疾病特別是缺血性腦損傷中的作用有待進一步研究。

圖2 培養大鼠星形膠質細胞GFAP和S100β免疫熒光染色（200×）

圖3 AMPK各亞基表達在培養的大鼠星形膠質細胞

總之，本研究發現在體外培養大鼠星形膠質細胞中有大量AMPK α2、β1及γ1亞基表達，提示AMPK在星形膠質細胞形成AMPK α2/β1/γ1三聚體在星形膠質細胞能量代謝調節中發揮重要作用，為進一步探討AMPK在缺血性腦損傷發生發展中的作用機制提供實驗依據。

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【點睛】本研究發現在體外培養大鼠星形膠質細胞中有大量AMPK α2、β 1及γ 1亞基表達，提示AMPK在星形膠質細胞形成AMPK α2/β1/γ1三聚體在星形膠質細胞能量代謝調節中發揮重要作用。