骨髓間充質干細胞對低轉移肝癌細胞的影響*

禹名卉 王福利 李天然

·基礎研究·

骨髓間充質干細胞對低轉移肝癌細胞的影響*

禹名卉① 王福利② 李天然③

目的：觀察人骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）對植入低轉移肝癌細胞動物模型生長的影響情況以及對轉移潛能和凋亡趨勢的影響。方法：制作人低轉移肝癌細胞MHCC97-L動物模型，將動物隨機分為模型實驗組、對照組。實驗組在接種腫瘤后第7 d開始尾靜脈注射BMSCs 5×105/只，模型對照組相同時間尾靜脈注射BMSCs培養液0.2 mL/只。于實驗開始后每周用卡尺測一次皮下腫瘤體積，分別于腫瘤接種后第14d（2周）、21 d（3周）、28 d（4周）、35 d（5周）、42 d（6周）處死動物，完整剖取瘤塊并稱瘤重和體積，計算腫瘤抑制率。Real-time PCR法檢測低轉移肝癌動物模型標本中轉移相關因子骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、骨唾液蛋白（bone salivary protein，BSP）、整合素（integrinαⅤ）基因以及凋亡相關因子Bcl-2、Bax、caspase3基因的表達。結果：骨髓間充質干細胞對腫瘤重量和體積的抑制作用在第3周具有統計學意義，實驗組腫瘤重量顯著低于對照組。骨髓間充質干細胞對腫瘤的抑制作用在第2、3、5、6周均具有統計學意義，實驗組腫瘤體積顯著低于對照組。實驗組腫瘤轉移相關因子表達均低于對照組，骨髓間充質干細胞干預后腫瘤促凋亡因子Bax、caspase3的表達呈升高趨勢，抗凋亡因子Bcl-2的表達逐漸下降。結論：骨髓間充質干細胞對低轉移肝癌細胞MHCC97-L的生長具有抑制作用，且第3周時抑制效果最好，隨著時間的延長，腫瘤抑制率逐漸下降。

骨髓間充質干細胞 肝細胞癌 動物模型 轉移 凋亡

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全世界最常見的惡性腫瘤之一，發病率有上升趨勢［1］。HCC逐漸從肝硬化發展為肝衰竭，最終導致全身侵襲和轉移，手術切除仍是目前最有效的治療手段［23］。肝移植由于其昂貴的治療成本以及供體器官的缺乏通常使該方法難以實施。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是骨髓衍生的非造血基質細胞［3］，是具有增殖能力和分化潛能的干細胞，能夠分化成多種類型的細胞，可以產生肝細胞以及間質細胞。BMSCs容易獲得，具有體外增殖的潛力并且不易丟失［4］。有研究表明BMSCs可以分泌一些肝細胞生長刺激因子促進肝細胞增殖［5］，包括人類生長因子HGF，血管生成因子VEGF，堿性成纖維細胞生長因子bFGF和許多白細胞介素。自體骨髓干細胞移植已被用于治療失代償性肝硬化，表明干細胞移植是一種新穎、安全有效的方法［3］。本實驗的前期研究中同時采用高、低轉移潛能肝細胞癌小鼠模型進行研究，研究結果顯示低轉移潛能肝癌細胞在BMSCs干預后OPN、β3、TGFβ1、αv表達下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）［6］。本文著重闡述BMSCs對低轉移肝細胞癌的作用，以期彌補低轉移肝細胞癌研究方面的空缺，為清楚闡明其作用機制提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 60只健康Balb/c裸鼠，體質量14～17 g，6周齡，雌雄各半，SPF級，由中國藥品生物制品檢定所實驗動物中心提供，實驗動物質量合格證號SCXK（京）2009-0017。實驗過程中對動物的處置符合醫學倫理學標準。

1.1.2 細胞株 人骨髓間充質干細胞，由廣州賽業科技有限公司提供。流式細胞分析結果顯示，BMSCs細胞表達CD29、CD44、CD105抗原均大于70%，表達CD45、CD14抗原均小于5%；進行成脂、成骨、成軟骨誘導分化實驗，分別經油紅O染色、茜素紅染色、阿利新藍染色呈陽性，檢測結果合格，符合試驗標準。人低轉移潛能肝癌細胞（MHCC97-L），由上海復旦大學肝癌研究所提供。

1.1.3 試劑 無菌0.9%氯化鈉注射液，由北京雙鶴藥業股份有限公司生產；無水乙醇（Ethyl alcohol，absolute A.R.），由北京北化精細化學品有限責任公司生產。

1.1.4 儀器及設備 一次性使用注射器（美國BD公司）、奧豪斯電子精密天平（U.S.A OHAUS coep）、電子數顯卡尺（桂林廣陸數字測控股份有限公司）、日本NIKON倒置顯微鏡、Olympus/PM-6顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 動物處理方法 取經體外細胞培養已在裸鼠體內皮下接種生長良好的MHCC97-L腫瘤結節，無菌操作制成瘤細胞小塊，用穿刺針接種于裸鼠腋窩皮下。將動物隨機分為模型對照組、實驗組，每組30只，稱體重標號。實驗組在接種腫瘤后第7 d開始尾靜脈注射BMSCs（5×105/只）。模型對照組相同時間尾靜脈注射BMSCs細胞培養液0.2 mL/只。裸鼠飼養在ⅣC-Ⅱ型（智能型）獨立送風隔離籠具屏蔽系統輔以潔凈層流柜的動物飼養室內，室溫20～22℃，相對濕度40%～60%。裸鼠食用滅菌裸鼠飼料（SPF級，中國醫學科學院實驗動物研究所產品）。于實驗開始后每周用卡尺測一次皮下腫瘤體積，分別于腫瘤接種后第14 d（2周）、21 d（3周）、28 d（4周）、35 d（5周）、42 d（6周）處死動物，完整剖取瘤塊并稱瘤重和體質量，計算腫瘤抑制率。

1.2.2 Real-time PCR法檢測基因表達 Real-time PCR法檢測低轉移肝癌動物模型標本中轉移相關因子OPN、BSP、IntegrinαⅤ以及凋亡相關因子Bcl-2、Bax、caspase3的表達。提取腫瘤標本RNA，進行濃度和純度測定，符合要求后用RevertAid?M-MLV RT反應系統和Oligo（dT）合成cDNA，經特異性引物聚合酶鏈反應（PCR）擴增相應的cDNA。PCR條件：預變性95℃、5 min；變性 94℃、30 s，退火 58℃、30 s，延伸72℃、30 s，共30個循環，最后72℃、10 min。PCR產物電泳并經凝膠電泳處理系統掃描半定量分析。

1.2.3 Real-time PCR引物序列設計 引物序列來自Gen Bank數據庫，由賽業（廣州）生物科技公司合成，以人肌動蛋白β-Actin為內參照物，引物序列如下（表1）。

1.3 統計學分析

采用SPSS24.0統計軟件進行統計學分析，所有數據以表示，組間比較采用t檢驗，相關分析采用Pearson積矩相關進行分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義，圖中所有均數相關數據均采用標準差進行作圖。

藥效判定標準：

2 結果

實驗組和對照組60只Balb/c裸鼠在造模過程中未出現死亡，數據記錄完整，均可用于結果分析。

2.1 實驗組與對照組腫瘤重量隨時間變化比較分析

隨著時間的延長，實驗組與對照組腫瘤重量均呈現增長趨勢，實驗組腫瘤在第2、3、4、5、6周分別為 0.05±0.01、0.12±0.05、0.27±0.05、0.57±0.22、0.79±0.12，對照組分別為0.07±0.05、0.21±0.01、0.39±0.15、0.87±0.32、1.12±0.23（g），實驗組腫瘤重量均低于對照組。統計學分析結果顯示實驗組與對照組腫瘤重量間的差異在第3周具有統計學意義（P=0.023），說明BMSCs在MHCC97-L生長的過程中表現出對其重量的抑制作用，并且抑制效果在第3周最為顯著。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.2 腫瘤重量抑制率

根據上述腫瘤抑制率計算公式分別求得2、3、4、5、6周腫瘤重量抑制率隨時間的變化情況，分別為28.57%、42.86%、30.77%、34.48%、29.46%。腫瘤重量抑制率在第3周達到峰值，隨著時間的延長呈現下降趨勢。

2.3 實驗組與對照組腫瘤體積變化對比

隨著時間的延長，實驗組與對照組腫瘤體積均呈現增長趨勢，實驗組腫瘤體積在第2、3、4、5、6周分別為134.37±33.17、224.00±27.34、359.52±71.96、457.07±59.87、695.68±72.99，對照組分別為 222.36±43.06、377.43±63.75、560.53±115.15、699.20±19.88、986.47±91.49（mm3），實驗組腫瘤體積始終小于對照組。統計學分析顯示實驗組與對照組腫瘤體積間的差異在第2、3、5、6周均具有統計學意義，P值分別為0.049、0.019、0.003、0.014。結果表明BMSCs表現出抑制腫瘤體積增長的作用，并且其抑制作用相對于重量抑制作用更為顯著，持續時間更長。

2.4 腫瘤體積抑制率

腫瘤體積抑制率計算公式同上述腫瘤重量抑制率計算公式，分別求得2、3、4、5、6周腫瘤體積抑制率隨時間的變化情況，分別為39.57%、40.65%、35.86%、34.63%、29.48%，腫瘤體積抑制率在第3周達到峰值，隨著時間的延長呈現下降趨勢。

2.5 腫瘤轉移相關因子

RT-PCR檢測結果顯示，應用BMSCs干預后，腫瘤轉移相關因子OPN、BSP、IntegrinαⅤ基因均為實驗組低于對照組。統計學分析顯示實驗組與對照組間OPN 表達差異第2、3、4、5、6周P值分別為 0.422、0.382、0.142、0.066、0.060；實驗組與對照組間BSP表達差異第 2、3、4、5、6周 P 值分別為 0.725、0.592、0.754、0.095、0.498；實驗組與對照組間IntegrinαⅤ表達差異第 2、3、4、5、6周P值分別為 0.251、0.422、0.111、0.037、0.182。

2.6 腫瘤凋亡相關因子

RT-PCR檢測結果顯示，應用BMSCs干預后，腫瘤促凋亡相關因子Bax表達量在第2、3、4、5、6周分別為1.01±0.14，1.42±0.15，1.79±0.19，2.31±0.24，3.16±0.26；caspase3表達量分別為1.01±0.14，1.91±0.13，2.84±0.30，3.42±0.36，4.38±0.41；腫瘤抗凋亡相關因子Bcl-2表達量分別為1.00±0.11，0.86±0.12，0.60±0.06，0.41±0.03，0.26±0.05。腫瘤促凋亡相關因子Bax、caspase3均呈升高趨勢，抗凋亡相關因子Bcl-2呈現下降趨勢。

2.7 BMSCs干預后MHCC97-L動物模型腫瘤重量抑制率與轉移及凋亡因子相關性分析

腫瘤重量抑制率與轉移相關因子OPN進行相關分析得P=0.664，r=-0.267；腫瘤重量抑制率與轉移相關因子BSP進行相關分析得P=0.540，r=-0.370；腫瘤重量抑制率與轉移相關因子IntegrinαⅤ進行相關分析得P=0.516，r=-0.390。腫瘤重量抑制率與促凋亡相關因子Bax進行相關分析得P=0.712，r=-0.228；腫瘤重量抑制率與促凋亡相關因子caspase3進行相關分析得P=0.771，r=-0.180；腫瘤重量抑制率與抗凋亡因子Bcl-2進行相關分析得P=0.703，r=0.235。相關分析顯示腫瘤重量抑制率與轉移相關因子及凋亡相關因子無相關（P＞0.05，圖1，2）。

2.8 BMSCs干預后MHCC97-L動物模型腫瘤體積抑制率與轉移及凋亡因子相關性分析

腫瘤體積抑制率與轉移相關因子OPN進行相關分析得P=0.269，r=0.616；腫瘤體積抑制率與轉移相關因子BSP進行相關分析得P=0.533，r=0.376；腫瘤體積抑制率與轉移相關因子IntegrinαⅤ進行相關分析得P=0.575，r=0.340。腫瘤體積抑制率與促凋亡相關因子Bax進行相關分析得P=0.010，r=-0.958；腫瘤體積抑制率與促凋亡相關因子caspase3進行相關分析得P=0.020，r=-0.934；腫瘤體積抑制率與抗凋亡相關因子Bcl-2進行相關分析得P=0.018，r=0.939。腫瘤體積抑制率與轉移相關因子OPN、BSP、IntegrinαⅤ基因無相關（P＞0.05），與促凋亡相關因子Bax、caspase3及抗凋亡相關因子Bcl-2顯著相關（P＜0.05）（圖3，4）。

2.9 通過動物模型熒光成像觀察BMSCs對MHCC97-L組織動物模型的干預作用

裸鼠皮下移植瘤模型進行熒光活體成像，預先打開活體成像儀20 min，將CCD相機冷卻到-25℃以下。檢測前使用1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉裸鼠，按照組別順序排列在活體成像儀拍攝倉內。使用激發光55 nm、發射光600 nm檢測，曝光時間為10 s。同時在無激發光、發射光條件下，0.17 s拍攝，保存明場圖像，熒光圖像采用軟件進行熒光強度分析。觀察BMSCs與肝癌組織細胞融合圖像發現BMSCs進入腫瘤組織。圖中腫瘤組織細胞呈綠色，BMSCs細胞呈藍色（圖5）。

圖1 腫瘤重量抑制率與轉移因子相關性分析Figure 1 Correlation analysis of tumor weight inhibition rate and transfer factor

圖2 腫瘤重量抑制率與凋亡因子相關性分析Figure 2 Correlation analysis of tumor weight inhibition rate and apoptosis factor

圖3 腫瘤體積抑制率與轉移因子相關性分析Figure 3 Correlation analysis of tumor volume inhibition rate and transfer factor

圖4 腫瘤體積抑制率與凋亡因子相關性分析Figure 4 Correlation analysis of tumor volume inhibition rate and apoptosis factor

圖5 BMSCs對肝癌（MHCC97-H）干預情況的病理切片熒光成像（fluorescence staining×200）Figure 5 Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on liver cancer(MHCC97-L)detected by fluorescence imaging(GFP label the tumor cells in green color,Ex,488 nm;Em,543 nm;DAPI mark the BMSCs in blue,Ex,358 nm;Em,461nm)(×200)

3 討論

手術切除仍為HCC治療的首選方法，但經手術切除治療后的患者仍具有較高的術后復發率和轉移率［7］。開辟新療法成為了肝癌研究領域的重要任務。1974年首次從骨髓中分離獲得BMSCs［8］，其具有對炎癥和腫瘤發生位點的趨向性［9］，容易在體外培養進行繁殖并維持自我更新能力，集中向炎癥組織和重塑組織遷移，具有較低的免疫原性和抗感染特性［10］，有助于器官和組織的快速修復，抑制免疫反應和抗肝纖維化。

BMSCs抑制MHCC97-L動物模型腫瘤增長的作用機制可能通過以下途徑進行。OPN通過結合其受體整合素αvβ3促進肝癌細胞株HepG膜型CD44v6表達，而CD44v6與透明質酸結合促進肝癌轉移，BMSCs通過抑制OPN與IntegrinαⅤ的表達來阻止肝癌的增長與轉移。Bax與Bcl-2基因是目前在凋亡調控中研究較多的基因，Bax基因屬于Bcl-2家族成員之一，Bcl-2蛋白表達減少或Bax蛋白表達增加時，促進細胞凋亡，而Bcl-2蛋白表達增加或Bax蛋白表達減少時，則抑制細胞凋亡［11］。關于Bax/Bcl-2的具體作用機制目前尚未完全明確［12］，可能通過調節促凋亡因子細胞色素C從線粒體的釋放，進而影響caspase 3的激活而發揮其作用。caspase 3是caspase家族中最重要的凋亡執行者之一，在細胞凋亡發生過程中扮演了關鍵角色。研究發現，caspase 3是肝星形細胞凋亡的重要途徑之一［13］。caspase 3正常以酶原的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段被激活，激活的cas?pase 3一方面通過水解特異性細胞蛋白直接導致凋亡，另一方面通過破壞DNA修復蛋白，如多聚ADP-核糖聚合酶，抑制DNA修復，協助凋亡的完成［14］。BMSCs通過增加Bax與caspase 3基因的表達，抑制Bcl-2基因的表達從而達到抑制腫瘤生長的作用。本研究中發現BMSCs干預后轉移相關因子OPN、BSP、IntegrinαⅤ基因的表達均低于干預前，促凋亡相關因子Bax和caspase 3呈增高趨勢，抗凋亡因子Bcl-2呈下降趨勢。相關性分析顯示腫瘤體積抑制率與凋亡相關因子顯著相關，表明腫瘤生長過程中受凋亡因子影響明顯，BMSCs可以通過調控轉移相關因子的表達以及增加促凋亡相關因子，減少抗凋亡相關因子的表達而抑制腫瘤的生長。

研究發現BMSCs能夠抑制肝細胞的炎癥反應，減少肝細胞凋亡，逆轉肝纖維化［15］，證實其具有修復受損肝組織的功能［16］。Abdelaziz等［17］發現BMSCs可以增加肝癌細胞的凋亡率。BMSCs可以減少轉化生長因子的表達從而達到抑制肝臟纖維化的作用。BMSCs已被認為是治療和預防HCC的分子療法的特定靶標［18］。但也有研究已經證明BMSCs有助于乳腺癌和前列腺癌腫瘤干細胞的發展［19］。有研究表明BMSCs分泌白介素IL-6會促進腫瘤細胞的轉移，IL-6是一種促炎細胞因子，報道顯示其能夠促進HCC［20］、胃癌［21］、乳腺癌［22］及肺癌［23］的轉移，但目前IL-6對BMSCs影響的作用機制及作用效果尚待研究。本實驗采用小鼠尾靜脈注射的方法證實了BM?SCs對MHCC97-L的生長確有抑制作用，為BMSCs在HCC治療中的應用提供了新證據。為明確BMSCs的抑瘤作用，以及使用BMSCs后腫瘤生長的實質性變化，尚需大量實驗研究進行證實。對于BMSCs的未來研究可以嘗試在小鼠原發性肝癌模型上進行，其能否廣泛應用于臨床腫瘤的治療以及應用效果如何有待于進一步的研究。

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Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on low metastatic hepatocellular carcinoma cells

Minghui YU1,Fuli WANG2,Tianran LI3

Fuli WANG;E-mail:wangfuli304@126.com

1Jinzhou Medical University PLA General Hospital First Affiliated Hospital Graduate Training Base,Jinzhou 121001,China;2Medical Department,First Affiliated Hospital of PLA General Hospital,Beijing 100048,China;3Radiology Department,First Affiliated Hospital of PLA General Hospital,Beijing 100048,China

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81271607)and China Postdoctoral Foundation(No.2015M572810)

Objective:Toobservetheeffect of humanbonemarrowmesenchymal stemcells(BMSCs)onthegrowth,metastasis andapoptosis of hepatocarcinoma cells with low metastatic potential.Methods:Mouse model with low metastatic liver cancer cells were used.Mice were randomly divided into the model experimental group and the control group.In the experimental group,BMSCs(5×105)were injected into the tail vein of each mouse on the 7th day after inoculation with hepatocarcinoma cells.Mice in the control group were injected with the culture solution(0.2 mL per mouse)of BMSCs through the tail vein at the same time.The subcutaneous tumor volume was measured every week after the start of the experiment.Animals were sacrificed at day 14(2 weeks),day 21(3 weeks),day 28(4 weeks),day 35(5 weeks),and day 42(6 weeks)after inoculation of tumor cells.Complete dissection of the tumor blocks was done and the tumor inhibition rate was calculated by weight and volume.Real-time PCR was used to detect the expression of the osteopontin,bone salivary protein,and integrinαⅤgenes and the expression of Bcl-2,Bax,and caspase3 genes.Results:The inhibitory effect of BMSCs on tumor weight was statistically significant at 3 weeks.The tumor weight of the samples from the experimental group was significantly lower than that of the samples from control group.The inhibitory effect of BMSCs on tumor volume was statistically significant at 2,3,5,and 6 weeks.The tumor volume of the samples from the experimental group was significantly lower than that of the samples from the control group.The expression of pro-apoptotic factors,Bax and caspase3,in BMSCs was increased,and the expression of anti-apoptotic factor,Bcl-2,decreased gradually.Conclusion:BMSCs inhibited the growth of low metastatic hepatocellular carcinoma cells.The inhibition rate on tumor weight and volume was highest at the third week,and the tumor inhibition rate decreased gradually with time.

bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs),hepatocellular carcinoma(HCC),animal model,metastasis,apoptosis

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.23.184

①錦州醫科大學解放軍總醫院第一附屬醫院研究生培養基地（遼寧省錦州市121001）；②解放軍總醫院第一附屬醫院醫務部；③解放軍總醫院第一附屬醫院放射科

*本文課題受國家自然科學基金（編號：81271607）和中國博士后基金（編號：2015M572810）資助

王福利 wangfuli304@126.com

（2017-10-25收稿）

（2017-12-12修回）

（編輯：鄭莉 校對：武斌）

禹名卉 專業方向為流行病與衛生統計學。E-mail：1213549627@qq.com