bFGF對hBMSCs增殖及成軟骨能力影響的實驗研究

趙丹丹 陶然 劉豫 曹誼林 周廣東

bFGF對hBMSCs增殖及成軟骨能力影響的實驗研究

趙丹丹 陶然 劉豫 曹誼林 周廣東

目的探索堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）對人骨髓間充質干細胞（hBMSCs）增殖和成軟骨能力的影響，并確定適用于hBMSCs體外軟骨構建的細胞代次。方法獲取hBMSCs，分別用DMEM和DMEM+bFGF培養基進行培養。兩組細胞均傳代至第4代，比較兩組各代次hBMSCs的形態變化、細胞得率；取第3代細胞，用pellet法體外成軟骨誘導培養3周，觀察兩組pellet大體觀并進行Ⅱ型膠原染色。在上述實驗基礎上，取hBMSCs用DMEM+bFGF培養基進行培養，1∶3傳代培養至第8代，觀察各代次細胞的形態變化；對各代次pellet體外成軟骨誘導培養3周后，行大體觀察并進行Ⅱ型膠原染色。結果DMEM+bFGF培養體系下的細胞形態、細胞得率及成軟骨能力等方面均優于DMEM組。DMEM+bFGF培養體系下，按照1∶3傳代的細胞傳至第6代仍能維持較好的細胞形態；第1～4代細胞均表達軟骨特異性細胞外基質Ⅱ型膠原，第5及后續代次的細胞成軟骨能力較差。結論bFGF可明顯促進hBMSCs增殖，并可更好地維持hBMSCs的成軟骨能力，在該培養體系下的第1~4代細胞適用于體外軟骨構建。

堿性成纖維細胞生長因子 人骨髓間充質干細胞 細胞代次 軟骨再生

軟骨缺損是常見的臨床治療難題，組織工程技術為軟骨缺損修復提供了新的思路[1]，基于組織工程技術進行軟骨缺損修復的可行性已在大量研究中得到證實，并有多個研究團隊已開展臨床試驗[2-3]。種子細胞，作為組織工程三要素之一，是軟骨組織工程臨床轉化需解決的首要問題。骨髓間充質干細胞（BMSCs）來源廣泛、易于取材，具有極強的體外增殖和軟骨分化潛能，被認為是軟骨組織工程臨床轉化理想的種子細胞來源之一[4-6]。在體外培養過程中維持其增殖和軟骨分化潛能，是BMSCs用于組織工程軟骨構建的關鍵。堿性成纖維細胞生長因子（bFGF），具有較強的促細胞增殖和軟骨再生能力[7-9]，是目前細胞培養最具代表性的生長因子之一。然而，目前bFGF研究主要以動物細胞為研究對象，bFGF對hBMSCs增殖和成軟骨能力的影響尚未確認。本研究以hBMSCs為研究對象，確定bFGF對其增殖和成軟骨能力的影響，并進一步確定其適用于體外軟骨構建的細胞代次，為hBMSCs用于軟骨組織工程臨床轉化提供依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料、試劑及儀器

骨髓取自上海第六人民醫院行髖關節置換手術的患者，共6例，每例 5 mL。患者平均年齡（50±5）歲。所有患者對實驗知情同意，并簽署知情同意書。

低糖DMEM培養基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素、兩性霉素 B、磷酸鹽緩沖液（Hyclone，美國）；bFGF（B&D，美國）；0.25%胰酶（Gibco，美國）；羊抗兔Ⅱ型膠原單克隆免疫抗體（DAKO，Oncogene TM，美國）、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（DAKO，Carpinteria，美國）。

組織處理儀 （Shandon，UK）、組織切片機（Slee Mainze，USA）、光學顯微鏡（Nikon ECLIPSE E600，日本）、恒溫 CO2培養箱（Forma Scientific，美國）、超凈工作臺（上海博迅實驗器材公司）、普通臺式離心機（TDL-40B，上海安亭醫療儀器廠）、倒置相差顯微鏡（Nikon ECLIPSE TS100，日本）。

1.2 實驗分組

對照組：低糖DMEM培養基 （含10%胎牛血清，青霉素、鏈霉素各100 U/mL）；實驗組：低糖DMEM+bFGF培養基（含10%胎牛血清，青霉素、鏈霉素各 100 U/mL，bFGF 5 ng/mL）。

1.3 hBMSCs分離培養及擴增

標本離心管中加入含10%FBS低糖DMEM培養液約40 mL，混勻制成細胞懸液，1 800 r/min離心10 min，輕輕吸除脂肪及大部分上清液，震蕩，細胞重懸，接種于100 mm培養皿，置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度培養箱中培養，5 d后首次換液。待細胞80%～90%融合時，0.25%胰酶消化，收集細胞懸液，1 500 r/min 離心 5 min，計數，按 0.5×106個有核細胞接種于100 mm培養皿。實驗組使用加bFGF的培養基，對照組使用不加bFGF的培養基。3～4 d后細胞可達到80%～90%的融合度，再次傳代培養。兩組細胞均傳代至第4代，每次傳代時觀察細胞形態變化，并計算細胞得率。

1.4 hBMSCs聚集體的形成（pellets）

取第3代的 hBMSCs制成0.4×106cells/mL的細胞懸液，將1 mL的細胞懸液移到15 mL的離心管中用于制成一個pellet，1 080 r/min離心 5 min，細胞在離心管底部形成一細胞團。棄上清后，加入成軟骨誘導液，每周換液2次，培養3周后行Ⅱ型膠原染色。

1.5 確定適和hBMSCs體外軟骨構建的細胞代次

在上述實驗基礎上，取原代hBMSCs用DMEM+bFGF培養基進行培養，1∶3傳代培養至第8代，觀察各代次細胞形態變化；取第1～6代細胞制備pellet，體外成軟骨誘導培養3周后，行大體觀察并進行Ⅱ型膠原染色。

2 結果

2.1 兩組培養體系中hBMSCs的形態變化

光鏡下觀察到實驗組細胞呈長梭型，邊緣較銳利，折光度增加，第1～4代細胞形態維持較好；對照組細胞生長較為緩慢、稀疏，第3、4細胞胞體增大，折光度差（圖1）。

2.2 兩組hBMSCs的細胞得率

本實驗中hBMSCs擴增基數均為 0.5×106個有核細胞，兩組第1代細胞擴增無明顯差異。第2～4代中，實驗組得率均高于對照組（P＜0.05），表明bFGF可維持細胞良好形態，更有利于細胞增殖（圖2）。

2.3 兩組hBMSCs的pellet和組織學觀察

實驗組pellet體積明顯大于對照組，呈瓷白色，略有光澤，有彈性；對照組彈性較差。Ⅱ型膠原染色顯示，實驗組可見黃色沉積和均勻的軟骨陷凹；對照組只有中間一部分黃染，周圍未見軟骨陷凹。提示bFGF對hBMSCs向軟骨分化有促進作用（圖3）。

2.4 DMEM+bFGF組連續傳代下細胞形態

觀察每一代細胞傳代后第2天的細胞狀態，發現第1~5代細胞呈長梭形，保持成纖維樣細胞生長；從第6代開始，細胞鋪展，細胞胞體變大呈星形、多邊形，呈現明顯老化狀態（圖4）。

2.5 DMEM+bFGF組連續傳代下的組織學觀察

Ⅱ型膠原染色顯示，第1～4代的軟骨基質中都可見黃色沉積和均勻的軟骨陷凹；第5代染色稍淡，但仍能看到明顯的軟骨形成；第6代染色偏淡，軟骨形成差（圖 5）。

圖1 hBMSCs在兩種培養體系下連續傳代培養的形態學觀察（40×）Fig.1 Morphologicalobservation of hBMSCs under successively passaged culture in two expansion systems(40×)

圖3 兩種不同體系的pellet大體觀及II型膠原染色比較Fig.3 Gross view and collagenⅡimmunohistochemical staining of hBMSCs'pellets in two expansion systems

圖4 各代次hBMSCs在DMEM+bFGF體系中連續傳代培養下的形態學觀察（40×）Fig.4 Morphological observation of hBMSCs under successively passaged culture in DMEM+bFGF expansion system(40×)

圖5 各代次pellet大體觀及II型膠原染色觀察Fig.5 Gross view and collagen II immunohistochemical staining of hBMSCs'pellets of each passage

3 討論

基于組織工程技術進行軟骨缺損修復已進入臨床轉化的關鍵階段。作為最具臨床應用前景的種子細胞之一，如何獲取足量的BMSCs以滿足大規模臨床應用的要求，仍需在大動物實驗的基礎上，以hBMSCs進行驗證[10]。

本實驗首先探討了bFGF臨床應用的必要性。bFGF有較強的促細胞增殖的作用，對BMSCs的促增殖作用已在動物實驗中得到證實[11]。本實驗進一步以hBMSCs為對象進行研究。結果顯示，在低糖DMEM+bFGF培養基中，第1～4代細胞呈長梭形，細胞量多，體積無明顯改變；而在低糖DMEM培養基中，細胞從第3代即開始鋪展、體積變大、排布稀疏；兩組除第1代的細胞得率無明顯差異外，DMEM+bFGF組第2～4代的細胞得率均明顯高于DMEM組。表明bFGF對hBMSCs的促增殖作用與動物實驗結果一致。pellet法可排除傳統組織工程方法中支架材料的干擾，因此，本實驗以pellet法驗證bFGF對hBMSCs成軟骨能力的影響[12]。結果表明，DMEM+bFGF培養體系下所構建pellet的體積為DMEM培養體系的2倍以上，且再生軟骨均質，具有典型的軟骨陷凹；而DMEM培養體系下所構建pellet體積小，再生軟骨不均質，僅局部可見典型的軟骨陷凹。提示bFGF培養體系下，hBMSCs具有更強的成軟骨能力，在軟骨再生臨床轉化中具有十分重要的應用價值。

雖然已有大量BMSCs用于軟骨缺損修復的研究，但是大部分研究所用細胞代次為第3代，究竟哪些代次的BMSCs適用于軟骨構建尚無系統研究[13]。本實驗在驗證bFGF應用必要性的基礎上，進一步探討了細胞代次對BMSCs軟骨再生能力的影響。細胞形態顯示，第1～5代細胞呈長梭形，保持成纖維樣細胞生長；從第6代開始，細胞鋪展，細胞胞體變大呈星形、多邊形，呈現明顯老化狀態。成軟骨能力評價結果表明，第1～6代構建了不同體積的pellet，均呈瓷白色，第1～4代細胞再生軟骨均質，并具有典型的軟骨陷凹，P第5代細胞再生軟骨不均質、僅局部區域具有軟骨陷凹，而第6代細胞再生組織無典型軟骨陷凹形成。提示bFGF體系下培養細胞在第1～4代仍保持良好的軟骨再生能力，第5代及后續代次細胞軟骨再生能力較差。與常用的第3代細胞相比，本研究為hBMSCs臨床應用的細胞代次選擇提供了更多借鑒。

綜上所述，bFGF可明顯促進細胞增殖，并在保持hBMSCs軟骨再生能力方面具有重要作用，因此在hBMSCs軟骨再生中的臨床應用中是必要的。同時，bFGF體系下，第4代之前代次的細胞軟骨再生能力良好，第5代及后續代次細胞軟骨再生能力較差，故建議以第1~4代BMSCs開展臨床應用。

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Experimental Study of the Impacts of bFGF on Proliferation and Chondrogenesis of Human Bone Marrow Stromal Cells

ZHAO Dandan1,2,3,TAO Ran2,3,LIU Yu2,3,CAO Yilin2,3,ZHOU Guangdong1,2,3．1 Plastic Surgery Research Institute,Weifang Medical College,Weifang 261042,China;2 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;3 National Tissue Engineering Center of China,Shanghai 200241,China.Corresponding author:ZHOU Guangdong(E-mail:guangdongzhou@126.com).

ObjectiveTo explore the effect of basic fibroblast growth factor (bFGF)on the proliferation and chondrogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells (hBMSCs),and to determine the cell generation schedule suitable for in vitro cartilage construction of hBMSCs.MethodshBMSCs were obtained and cultured respectively in two culture systems:DMEM and DMEM+bFGF.Two groups of cells were repeatedly passaged to P4 generation,the morphological changes and cell yield rates of hBMSCs were compared between the two groups.At the same time the two groups of P3 cells were induced forchondrogenic differentiation using pelletculture for3 weeks in vitro.Gross observation,immunohistochemical staining of collagenⅡwere used to evaluate the results of each group.Based on the study mentioned above,the DMEM+bFGF culture group was subcultured to P8 to observe the morphological changes of each subculture.After chondrogenic differentiation using pellet culture for 3 weeks in vitro,gross observation and immunohistochemical staining of collagenⅡwere evaluated as before.ResultsThe cell morphology,cell yield and cartilage differentiation in DMEM+bFGF group was far greater than that of DMEM group.Under the culture system of DMEM+bFGF,cells passaged at 1∶3 could still maintain a good cell morphology in P6 generation.Immunohistochemistry showed that cartilage-specific extracellular matrix typeⅡcollagen was expressed better in P1-4 generation.ConclusionbFGF can significantly promote the proliferation andchondrogenesis of hBMSCs.P1-4 generation cells in DMEM+bFGF culture system is suitable for in vitro cartilage construction.

Basic fibroblast growth factor;Bone marrow stromal stem cells; Cell generation; Cartilage regeneration

Q813.1+2

A

1673－0364（2017）06－0318－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.06.004

261042 山東省濰坊市 濰坊醫學院整形外科研究所（趙丹丹，周廣東）；200011 上海市 上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院整復外科，上海市組織工程研究重點實驗室（趙丹丹，陶然，劉豫，曹誼林，周廣東）；200241 上海市 組織工程國家工程研究中心（趙丹丹，陶然，劉豫，曹誼林，周廣東）。

周廣東（E-mail：guangdongzhou@126.com）。

2017年10月11日；

2017年10月28日）