臍帶間充質干細胞鞘內注射治療脊髓損傷的長期臨床觀察

劉靜 韓冬梅 薛梅 閻洪敏 董磊 朱玲 郭子寬 王恒湘

臍帶間充質干細胞鞘內注射治療脊髓損傷的長期臨床觀察

劉靜 韓冬梅 薛梅 閻洪敏 董磊 朱玲 郭子寬 王恒湘

目的觀察臍帶間充質干細胞（UC-MSCs）鞘內注射治療脊髓損傷（SCI）的臨床療效及安全性。方法對2008年1月至2013年10月收治的35例SCI患者，給予UC-MSCs鞘內注射治療，共46療程，每次輸注細胞1×106cells/Kg，1次/周，4次為1個療程。采用美國脊髓損傷協會制定的脊髓損傷神經功能評分標準（ASIA標準），對患者治療前后神經功能進行評定；采用國際神經修復學會脊髓損傷功能評價量表（IANR-SCIRFS），對患者治療前后日常生活活動能力進行評定。結果35例患者中22例有效，有效患者治療結束后1個月（與治療前相比），其痛覺、觸覺、運動、日常生活活動能力評分均明顯升高（P＜0.01）。9例有效的患者接受了2～3個療程治療，7例療效有進一步提高。25例不完全性SCI患者有效率達88%，10例完全性SCI患者均無效。治療后個別患者出現頭痛、腰痛或發熱，均在1～3 d內消失。隨訪45～114個月（平均84個月），無治療相關不良事件發生，有效患者療效穩定。結論UC-MSCs鞘內注射治療是安全的，可改善大部分不完全性SCI患者的神經功能，多療程治療有可能使患者療效得到進一步提高。

臍帶間充質干細胞 脊髓損傷 鞘內注射

SCI是一類中樞神經系統的嚴重致殘性疾病，常導致癱瘓及大、小便失禁，對患者的生活質量造成很大影響。傳統的手術、藥物、康復等在促進患者神經功能恢復上并未取得顯著進展，而通過細胞治療保護甚至替代損傷神經元及膠質細胞已成為當前神經再生的新策略。UC-MSCs來源于臍帶，易于獲取，體外能夠大量擴增，且低免疫原性。我們將體外擴增的UC-MSCs經鞘內注射治療35例SCI患者，取得較好療效，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2008年1月至2013年10月收治的35例SCI患者。其中，男27例，女8例，年齡18～51歲（平均34歲）。損傷部位：頸髓6例，頸髓+胸髓3例，胸髓15例，胸髓+腰髓2例，腰髓7例，頸髓+胸髓+腰髓1例，腰骶髓1例。損傷時間2～204個月（平均56個月）。損傷原因：外傷所致30例，包括高空墜落11例，車禍9例，砸傷6例，跳水損傷2例，摔傷、槍傷各1例；疾病所致5例，包括脊髓炎后遺癥2例，脊髓栓系綜合征、放射性脊髓病、脊髓前動脈綜合征各1例。治療方法及風險均如實告知患者，患者均簽署知情同意書，治療方案經醫院醫學倫理委員會批準。所有患者均具有干細胞治療適應證：無發熱、感染，無凝血功能及心、肺、肝、腎等重要臟器功能障礙。術前對患者進行總體評估：體格檢查，ECG、脊髓損傷部位MRI檢查，血、尿、便常規、肝腎功能、凝血、手術感染8項。

損傷完全性評定：完全性損傷為損傷平面以下包括骶4～5既無感覺也無運動功能；不完全性損傷為損傷平面以下包括骶4～5有感覺（或）運動功能。35例患者中，25例為不完全性損傷，10例為完全性損傷。

1.2 方法

1.2.1 UC-MSCs制備

[1]的方法，稍加改良后進行UC-MSCs制備。簡言之，經知情同意及感染源檢定后收集臍帶，去除外膜和動靜脈，將臍帶剪成0.5 cm3大小的組織塊，加入等體積0.2%Ⅰ型膠原酶，37℃消化過夜。次日，加入兩倍體積的0.05%的胰蛋白酶，37℃消化1 h。2 000 r/min離心10 min收集細胞，計活細胞數。將細胞懸浮于hMSC無血清培養基（杭州百威生物技術有限公司）中，按106cells/cm2底面積接種于塑料培養瓶中。1周后出現由數十個形態類似于成纖維細胞組成的集落。加入0.05%胰蛋白酶消化，并按6 000 cells/cm2底面積進行傳代培養。利用流式細胞技術測定細胞表型，常規感染源檢定后，收集細胞用于治療，或收獲細胞放于-80℃冰箱凍存備用。使用前，在37℃環境下快速復蘇，24～48 h培養，收獲貼壁生長的細胞供臨床應用。

1.2.2 UC-MSCs注射

入院第3或第4天開始給患者行腰穿，鞘內注射UC-MSCs，1次/周，4次為1個療程。按診療常規進行腰穿，將 UC-MSCs 10 mL（1×106cells/Kg）+地塞米松5 mg在10 min內緩慢注入蛛網膜下腔，拔針，敷以無菌輔料，囑患者去枕平臥6 h。

治療有效的患者前1療程治療結束3～6個月后且無進一步好轉跡象時，經本人同意，即可給予下一療程治療。治療期間給予患者常規的系統康復訓練作為輔助治療。

1.2.3 評估標準[2]

采用美國脊髓損傷協會制定的脊髓損傷神經功能評分標準（ASIA標準），對患者治療前后神經功能進行評定：檢查頸2到骶4～5神經支配的身體兩側各自28個皮節區痛覺和觸覺，按消失、減退、正常分別給予 0、l、2分，痛覺、觸覺總分均為112分；檢查頸5到骶1神經支配的身體兩側各自10個肌節中的關鍵肌，按肌力0～5級分別給予0～5分，總分為100分。

采用國際神經修復學會脊髓損傷功能評價量表（IANR-SCIRFS），對患者治療前后日常生活活動能力進行評定，包括上、下肢、軀干、全身運動功能、括約肌功能、肌張力、泌汗、皮膚營養、疼痛，最高分48分為正常。分值越低表示神經功能缺損越嚴重，日常生活活動能力越差。

1.2.4 不良反應及并發癥觀察

觀察治療中及治療后有無發熱、腰痛、頭痛、頭暈等不良反應。

1.2.5 隨訪

患者治療后3個月隨訪，之后每6個月隨訪1次，觀察病情變化。

1.2.6 統計學分析

2 結果

35例患者，22例治療有效，總有效率62.86%。25例不完全性SCI患者中22例有效，有效率達88%，3例無效。有效患者ASIA評分及IANRSCIRFS評分顯示，治療結束1個月后（與治療前相比），其痛覺、觸覺、運動及日常生活活動能力評分有明顯提高（P＜0.01）；10例完全性SCI患者均治療無效（表 1、2）。

表1 22例有效患者治療前后的評分Table 1 Scores of 22 effective patients before and after therapy

表2 不完全性SCI與完全性SCI患者治療前后的評分Table 2 Scores of incomplete SCI patients and complete SCI patients before and after therapy

22例有效患者中13例接受了1個療程治療，7例接受了2個療程治療，2例接受了3個療程治療。7例接受2個療程治療的患者中，5例經第2療程治療后神經系統功能得到進一步提高，2例第2療程治療前后無變化；2例接受3個療程治療的患者中，1例每療程治療后神經系統功能均得到進一步提高，另1例前2個療程治療后神經系統功能均得到進一步提高，第3療程治療前后無變化。有效患者多表現為運動和/或感覺功能改善，大小便控制力增強。

脊髓損傷部位存在軟化灶的7例患者中，4例為不完全性SCI，3例為完全性SCI。其中2例不完全性SCI患者有效，余均無效。

有效的22例患者損傷至治療的平均時間為49個月（2～204個月），無效的13例患者平均為51個月（4～144 月），兩組無顯著差異（P＞0.05）。

UC-MSCs治療中及治療后，患者的生命體征均平穩。2例治療后感頭痛，2例治療后感腰痛，1例治療后出現發熱，未經特殊處理，1～3 d后癥狀消失。頭痛患者表現為立位、坐位、活動時頭痛加重，臥位時頭痛減輕或消失，考慮系腰穿術后出現低顱壓綜合征，在后續治療中通過增加鞘注液體量至15 mL緩慢鞘注后未再出現頭痛，無其他不良反應。

22例有效患者共接受了33個療程的治療，其中31個療程治療有效：18個療程治療結束1個月后療效不再增加；8個療程治療結束3月后療效不再增加；4個療程治療結束6個月后療效不再增加；1個療程治療結束1年后療效不再增加。35例患者結束治療至2017年8月平均84個月 （45～114個月），無治療相關不良事件發生，有效患者療效穩定，13例無效患者病情無變化。

3 討論

SCI表現為損傷平面以下感覺、運動功能喪失和大、小便失禁，呈高發生率、高致殘率、高耗費、發病年輕化等特點。SCI可分為外傷性和非外傷性兩種，外傷是SCI的主要原因。本組86%的患者因外傷所致，前3位的原因為高空墜落、車禍和砸傷。SCI由原發性損傷（包括機械損害、出血等）和繼發性損傷（包括水腫、炎癥反應、缺血、細胞因子、再灌注等對脊髓產生的繼發性損傷）引起，恢復極為困難。間充質干細胞（MSCs）來自中胚層，具有自我更新及多向分化的潛能，在適宜的條件下可分化為神經元及神經膠質細胞[3]，并可分泌大量的生物活性物質[4]，為SCI的治療提供了新的手段。動物實驗已證明，在不同的SCI模型中，應用MSCs可明顯改善神經功能，如促進肢體感覺、運動功能恢復，減少脊髓空洞的形成，橋接損傷神經，促進軸突生長等[5-7]。在SCI慢性期可通過細胞替代、脊髓空洞填充、膠質瘢痕的修復、軸突生長而促進神經功能的修復[8-9]。MSCs治療中樞神經系統損傷（SCI、顱腦損傷）及疾病（脊髓小腦性共濟失調、多系統萎縮、肌萎縮側索硬化癥、腦癱、腦卒中等）尚處于Ⅰ期及Ⅱ期臨床試驗階段，顯示MSCs治療是安全有效的[10-15]。UC-MSCs來源于臍帶沃頓膠，易于分離和體外大量擴增，免疫原性低，適于臨床應用。前期臨床試驗中，我們將體外擴增的UC-MSCs鞘內注射給22例SCI患者，表明UC-MSCs鞘內注射是安全的，對不完全性SCI患者的有效率達81.25%，有效患者通過增加療程數，療效有一定提高[16]。在此基礎上，現擴大病例數至35例，共46療程治療。結果顯示，在不完全性SCI患者中有效率高達88%，主要表現為：①肢體肌力增加，肌張力下降，運動能力及生活自理能力增強；②感覺平面的下移，異常感覺的改善或消失；③小便控制能力增強，排便功能改善。但是，本方法對于完全性SCI患者無效；另外，SCI若存在軟化灶，也會對療效產生不利影響。

MSCs修復SCI的機制還不完全清楚，可概括為以下幾個方面[5，10，17]：①通過分泌神經營養因子（腦源性神經營養因子、血管內皮細胞生長因子、神經生長因子、膠質細胞源性神經營養因子、胰島素樣生長因子1）保護殘存的神經元，促進殘存神經元軸突再生及突觸形成，促進損傷局部血管再生。②改善脊髓損傷后的局部微環境，減輕炎癥反應，減少受損脊髓周圍組織的繼續壞死，減少脊髓空洞及膠質瘢痕的形成。③在脊髓特定的環境下，分化成神經元、膠質細胞，促進軸突再生并幫助其髓鞘化，重建神經環路。移植的MSCs被觀察到是通過分泌營養信號而非通過在損傷部位的植入或分化而發揮治療作用[18]。另外，MSCs也可通過釋放含有大量生物活性分子（脂質、蛋白質、mRNA、miRNA等）的微泡及外泌體到胞外，促進損傷脊髓組織的修復與再生[19-20]。

目前，細胞治療的途徑主要有鞘內注射、靜脈輸注、損傷局部注射。雖然損傷局部注射可以將MSCs直接注射到損傷區周圍，以促進神經細胞功能的改善和恢復，但此方法有導致穿刺處脊髓二次損傷及局部出血的可能性。經靜脈輸注MSCs懸液，方法簡單易行，風險較小，但是到達損傷局部的細胞數量較少，難以取得較理想的治療效果。鞘內注射可有效避免上述兩種治療途徑存在的問題，簡便易行，對機體損傷小，進入蛛網膜下腔的MSCs可以遷移到損傷部位，并修復受損的神經細胞[21]。

Garbossa等[22]認為，在膠質瘢痕形成前數周為最佳移植時間；Syková等[23]認為，干細胞移植的最佳時間窗是SCI后3~4周內，既可避免急性期各種炎性因子對移植細胞的損害，又可避免慢性期膠質瘢痕對軸突再生的干擾。臨床上大部分SCI患者均處于慢性期，藥物及康復治療難以使損傷的神經功能得到進一步恢復。本組患者多在SCI慢性期接受MSCs治療，不完全性SCI患者有效率高達88%，提示在SCI慢性期MSCs鞘內注射治療是有效的。

由于鞘內注射的MSCs生存時間有限[24]，多次重復注射可能是改善患者神經功能的關鍵。Vaquero等[25]給予10例不完全SCI患者重復鞘內注射自體MSCs， 每次為 3×107個， 共 4 次 （第 1、4、7、10 個月），所有患者感覺、運動、排尿、排便功能均有不同程度改善。我們采取多次注射的方法 （每周1次，4次為1個療程）。結果顯示，25例不完全性SCI患者中22例有效，對于1個療程治療有效的9例患者繼續給予1~2個療程治療 （每次間隔3~6個月），7例神經功能均有進一步改善，提示多次、多療程治療有可能使患者神經功能改善程度最大化。

本研究證實了UC-MSCs鞘內注射的安全性，35例患者共計46療程、184次鞘內注射，未出現嚴重不良反應，僅個別患者出現頭痛、腰痛、發熱，未經特殊處理，1~3 d后癥狀消失。長期隨訪（平均84個月）顯示，本組患者中無治療相關不良事件發生。

本研究表明，UC-MSCs蛛網膜下腔注射治療SCI是安全的，可使大部分不完全性SCI患者神經功能在一定程度上得到恢復，2~3個療程治療有可能使療效得到進一步提高，有效患者療效穩定。

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Long-Term Clinical Observation of Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells in Treating Spinal Cord Injury by Intrathecal Injection

LIU Jing1,HAN Dongmei1,XUE Mei1,YAN Hongmin1,Dongl Lei1,ZHU Ling1,GUO Zikuan2,WANG Hengxiang1．1 Department of Hematology,General Hospital of the Air Force,Beijing 100142,China;2 Department of Experimental Hematology,Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850,China.Corresponding author:WANG Hengxiang(E-mail:wanghengxiang123@aliyun.com).

ObjectiveTo observe the clinical efficacy and safety of umbilical cord mesenchymal stem cells(UC-MSCs)in treating spinal cord injury (SCI)by intrathecal injection.MethodsFrom January 2008 to October 2013,35 admitted patients with SCI were given UC-MSCs by intrathecal injection for 46 courses,at a dose of 1×106cells/kg body weight once a week,4 times as a course.American Spinal Injury Association (ASIA)standard and International Association of Neurorestoratology SCI Functional Rating Scale (IANR-SCIFRS)were used to evaluate SCI patient＇s neural function and ability of daily living.ResultsAmong 35 cases,22 cases were effective.Compared with the scale before therapy,effective patients＇algaesthesis,tactile sensation,motion,activity of daily living scale were obviously increased one month after therapy(P＜0.01).Nine effective patients

2 to 3 courses of treatment,the effects of 7 cases were further enhanced.The effective rate of 25 cases with incomplete SCI was 88.46%,whereas all of 10 cases with complete SCI had no response.After therapy,there were headache,lumbago or fever in individual patients and disappeared within 1-3 days.All patients were followed up for 45 months to 114 months(average 84 months),no treatment-related adverse events happened.The effect was stable in effective patients.ConclusionUC-MSCs therapy by intrathecal injection is safe,and can ameliorate most of incomplete SCI patient＇s neurological function,multiple courses of treatment is likely to further improve the efficacy of patients.

Umbilical cord mesenchymal stem cells;Spinal cord injury;Intrathecal injection

王恒湘（E-mail：wanghengxiang123@aliyun.com）。

R651.2

A

1673－0364（2017）06－0313－05

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.06.003

首都發展基金項目（2007-2033）；國家高新技術研究發展計劃 （863項目，2007AA022454）；國家重大新藥創制基金（20092x09503-019）；軍隊臨床高新技術重大項目（2010gxjs049）。

100036 北京市 空軍總醫院血液科（劉靜，韓冬梅，薛梅，閻洪敏，董磊，朱玲，王恒湘）；100142 北京市 北京放射與輻射醫學研究所（郭子寬）。

2017年10月9日；

2017年11月23日）